BET抑制剂抑制肝癌生长的功能和机制研究文献综述

 2022-12-24 03:12

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

  1. 研究背景及目的

肝癌是全球发病率位居第五，我国死亡率位居第二的恶性肿瘤，具有高侵袭性和预后差的特点，主要病理分型为肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）1。临床针对早期HCC患者的有效治疗手段包括肝切除和肝移植等手术治疗和局部消融及TACE等局部治疗。但因起病不易察觉，发现时已是中晚期无法进行手术切除，常需进行系统化疗和放疗。然而肝癌不仅对传统的细胞毒性药物不敏感，且因药物对肝脏损伤较大往往会加重肝硬化而造成病情加重。因此，探索分子靶向药物治疗和免疫治疗成为肝癌治疗研究的热点与突破口2。

溴结构域蛋白和末端外域蛋白（bromodomain and extra-terminal domain，BET）是由两个串联的溴结构域（BD1、BD2）和末端结构域组成的表观遗传阅读器，识别与DNA松散结合的乙酰化的组蛋白赖氨酸，调控细胞周期蛋白及细胞凋亡相关的基因转录，参与肺纤维化、睾丸核蛋白腺癌、急性髓性白血病等多种疾病的发生和发展3。BET家族包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT，其中BRD4不仅作为支架募集转录因子，而且磷酸化RNA聚合酶Ⅱ，在炎症和癌症的发展中起着关键作用4。

在肺癌、乳腺癌、急性髓性淋巴瘤和黑色素瘤中，靶向BRD4的小分子如二氮嗪类JQ1、喹啉酮类I-BET和喹唑啉酮类Pfi-1等是组蛋白乙酰化赖氨酸的竞争性抑制剂，可能通过抑制细胞周期蛋白表达阻滞细胞周期或者抑制c-Myc、Bcl-2等原癌基因的表达，表现出良好的抗癌作用5。但目前的研究表明在不同的恶性肿瘤中，BRD4抑制剂诱导细胞凋亡的能力和受调控的靶基因及信号通路各不相同，那么在HCC中BRD4及其抑制剂调控细胞增殖的机制在肝癌发展及治疗中扮演了何种角色？本研究以此为重点，讨论BRD4在HCC中的表达及功能，并探讨BET抑制剂在抑制肝癌细胞中的药理机制。

  1. 研究方法
  2. Western blot检测不同HCC细胞系和正常肝细胞系BRD4的表达情况

Western Blot法即蛋白质印迹法，是一种检测目的蛋白在特定细胞或组织中表达情况的方法。其原理是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同分子大小的蛋白质样品，并转移到以非共价键形式吸附蛋白质的固相载体如硝酸纤维素薄膜上。固相载体上的蛋白质为抗原，先与可以与其产生免疫反应的第一抗体结合，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，经过显色或显影检测目的蛋白的表达情况。检测Hep3B、HepG2、SMMC7721、HCCLM3等HCC细胞系和L02正常肝细胞系中BRD4的表达，选择BRD4高表达的HCC细胞系进行培养及后续实验。

  1. MTT检测不同抑制剂对HCC细胞增殖的影响

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在540 或720nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比6。检测JQ1、I-BET、Pfi-1等不同BET抑制剂对高表达BRD4的HCC细胞增殖的影响，并对剂量依赖性进行考察。

  1. 流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡，推测BET抑制剂抑制增殖的机制

流式细胞术是一种判断化合物是否通过阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡来发挥其抗肿瘤作用的方法。细胞增殖周期可分为G1、S、G2和M四期。在细胞周期的各个阶段,细胞内部的主要生理状态不同：G1期是从上次有丝分裂结束到DNA复制前的一段时期,这一时期细胞主要是进行RNA和核糖体的生物合成以及能量储备；S即DNA合成期,主要任务是进行DNA的复制合成,同时还要合成组蛋白,另外DNA复制所需要的酶都在这一时期合成；G2期为DNA合成后期,是有丝分裂的准备期,在这一时期,DNA合成终止,但还有RNA和蛋白质的合成；M为细胞的有丝分裂期,此期间,染色质逐渐浓缩形成染色体,随后染色体进行移动分裂,细胞也逐渐分裂为两个子细胞。根据肿瘤细胞周期的改变,可推断化合物主要作用于细胞周期的哪一阶段,根据这一阶段的细胞周期特异蛋白表达,可对抑制剂的机制做初步推测7。

  1. RT-PCR和Western blot检测BRD4下游基因c-Myc及细胞周期蛋白和凋亡相关基因的表达

RT-PCR（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction）是一种检测细胞中目的基因mRNA表达水平的方法。在反转录酶的作用下，目的基因的mRNA逆转录合成cDNA，再在DNA聚合酶的作用下利用特异性引物扩增目的基因片段，利用DNA电泳或具有荧光探针的实时定量RT-PCR推断目的基因的初始量8。RT-PCR与Western blot的结果将共同证明目的基因在BET抑制剂处理后的HCC细胞中的表达水平。

  1. 文献综述

原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）的发生机制尚未明确，一些研究表明肝癌的发生是遗传学和表观遗传学的共同作用所致，其中表观遗传学包括组蛋白乙酰化和甲基化修饰、DNA甲基化和非编码RNA调控，成为肝癌治疗的热点。BET抑制剂就是靶向组蛋白赖氨酸乙酰化而作为一种表观调控药物，诱导细胞周期阻滞或细胞凋亡而抑制肿瘤增殖。

BET抑制剂在癌症治疗中发挥了明显作用。Jennifer A. Mertz等报道二氮嗪类BET抑制剂JQ1通过降低内源性c-Myc表达在各种白血病、多性淋巴瘤等骨髓瘤细胞系和小鼠异种移植burkitt淋巴瘤中具有显著的抗肿瘤作用，这种抑制作用可被外源性c-Myc表达逆转9。Mark A Dawson等报道喹啉酮类I-BET151 通过抑制c-Myc、BCL2 和 CDK6 的转录在混合系白血病中发挥抗增殖活性10。BRD4的高表与JQ1和I-BET都通过下调BRD4表现出抗癌效果，可能证明了BRD4 在其中的作用。

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