方法开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、拟研究或解决的问题
- 研制M1型巨噬细胞－支原体膜融和疫苗
- 探究M1型巨噬细胞－支原体膜融和疫苗的体内活性作用
二、采用的研究手段
- 利用干扰素gamma;(IFN -gamma;）诱导M1巨噬细胞，获取CD64表达的M1巨噬细胞膜
- 用PEG诱导M1巨噬细胞与肺炎支原体膜融合制备疫苗
- 设置免疫组与对照组小鼠，每组5只，对照组注射PBS，免疫组注射制备的疫苗，肌肉注射免疫，采血分离血清，检测血清中抗体水平。对比两组小鼠血清中抗体水平，进行疫苗体内活性评价
三、文献综述
支原体（mycoplasma）的大小介于细菌与病毒之间，是目前所知能营养生活的最小的原核细胞微生物。它缺乏细胞壁，呈高度多形性，可寄居于细胞表面及内部，多数不治病，但少数支原体可逃避宿主免疫系统及抗生素的攻击，有利于其潜伏或形成慢性感染[1]。支原体与宿主细胞之间密切的相互作用，如细胞膜成分的互换，可能启动从细胞膜到核的信号转导，改变许多基因的表达。此外，支原体长期的存在可以通过炎症反应诱导各种细胞因子产生，从而对细胞的增生和分化发挥作用，进而有可能影响肿瘤的发生发展[2]-[3]。因此对支原体感染的预防也是很有必要性的。
肺炎支原体,即M.Pneumonia,通常被简称为MP,是一种原核微生物,其细胞体积介于病毒与细菌之间,是目前研究发现的可以实现独立生活的最小原核生物,同时具备某些细胞的特质。另外,引起支气管炎和肺炎的主要病原体也可包括肺炎支原体,所导致系统病变可包括血液、神经、消化、泌尿、皮肤等系统。近几年来,随着时代和[4]病原学的发展变迁,肺炎支原体逐渐变成诱发小儿呼吸道感染的重要病原体之一。肺炎支原体（MP）还是社区获得性肺炎的主要病原体，其可引起成人和儿童呼吸道感染 ，从而可导致部分人群出现过敏性哮喘。另外 ，肺炎支原体亦可加重肺部疾病 ，引起一些并发症。治疗肺炎支原体感染 ，常选用干扰DNA复制 、RNA转录或抑制蛋白质合成的抗菌药物 ，如大环内酯类、四环素类 、氯霉素类 、喹诺酮类等[5]。但现已有的抗支原体肺炎药物或多或少存在抗性不足的现象 ，并且随着耐药菌株的不断出现 ，已经越来越不能满足临床治疗的需要 ，因此肺炎支原体疫苗的研发逐渐成为热点。目前 ，正在使用的肺炎支原体疫苗均应用在猪 、牛 、羊等动物领域 ，并以灭活疫苗为主，人用的针对性较强的抗支原体肺炎疫苗正处于研究阶段[6]。
生物体对外界异物的抵抗力,一般称为免疫(immune)。免疫学上把凡能剌激生物体产生免疫反应的大分子物质称为抗原(antigen)。抗原刺激引起生物体产生特异性的蛋白质去对付它,这种“解毒物质”称为抗体(antibody)。细胞膜上也存在有这一类可以起到抗原作用的大分子物质,就是细胞膜抗原。细胞膜上具有遗传学上已确定了的抗原性,使细胞表面赋有免疫化学的特性[7]。
肺炎支原体有细胞膜、胞浆抗原,但不存在细胞壁,而其中膜抗原为糖脂质。但支原体膜的免疫原性很差，真皮树突状细胞和朗格汉斯细胞对其识别较差，利用支原体膜制作疫苗难以被识别单独用支原体膜制作疫苗不能得到理想的效果[4]。
CD64是相对分子质量为72000的穿膜糖蛋白 ，属免疫球蛋白（IgG）超家族成员，是高亲和力的IgG受体 ，可直接与 IgG结合并在体内达到饱和。它主要分布在单核细胞 、巨噬细胞及树突状细胞等抗原递呈细胞表面，而在外周血的中性粒细胞表面表达水平低。CD64是连接细胞免疫和体液免疫的纽带，在细胞吞噬清除免疫复合物、抗原递呈和释放炎症介质中起到关键作用。大量的研究显示中性粒细胞CD64是一项高敏感、高特异的诊断感染性疾病的早期标志物 ，能够区分自身免疫性疾病活动期或合并感染 ，并可监测抗菌药物疗效和术后是否并发感染 ，有良好的临床应用前景。CD64 参与先天或后天免疫应答，具有信号传导作用、介导细胞毒作用 、介导吞噬作用 ，这些功能在吞噬细菌与免疫复合物的过程起着非常重要的作用 。当机体感染或内毒素入侵时，细菌细胞壁的脂多糖(LPS)、粒细胞集落刺激因子(G—CSF)、干扰素gamma;(IFN -gamma;）等大量致炎因子释放 ，导致中性粒细胞激活 ，CD64 表达水平显著升高[10]。实验显示，用干扰素gamma;(IFN -gamma;）诱导M1巨噬细胞后，其细胞膜上CD64含量明显高于对照组[8]-[9]
利用干扰素gamma;(IFN -gamma;）诱导的M1巨噬细胞膜，使其细胞膜表面表达CD64。利用PEG诱导细胞膜融合的方法诱导M1巨噬细胞膜与支原体膜融合制作疫苗，由于CD64的作用，可以提高树突状细胞对于疫苗的识别，吞噬以及抗原递呈，使疫苗能在体内发挥作用。
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