一．选题背景与意义：
L-5-甲基四氢叶酸是体内叶酸的主要活性形式，在人的生命活动中起着不可或缺的作用。普通叶酸只有转换为L-5-甲基四氢叶酸才能参与甲基化过程以及DNA合成。它是人体血浆和细胞内的游离叶酸存在的唯一形式；也是唯一可以穿透血脑屏障的叶酸类药物，对退行性神经系统类疾病有很好的防治作用[1~3]。此外它还可以与抗癌药物甲酰蝶呤等配伍使用，降低抗癌药物的毒副作用。目前L-5-甲基四氢叶酸已被用于巨幼红细胞性贫血、风湿性关节炎等多种疾病的辅助治疗。美国、日本和欧洲已经批准L-5-甲基四氢叶酸上市，作为一种食品添加剂添加到各种食品中，使得L-5-甲基四氢叶酸的市场需求量剧增。
目前，L-5-甲基四氢叶酸的生产主要依靠化学方法合成。但在合成过程中会不可避免的产生难以拆分的光学异构体D-5-甲基四氢叶酸[4]，此异构体不能被人体吸收利用，无治疗保健作用。并且该方法对合成工艺的要求极高，使得生产成本也较高。需要寻找一种新方法降低生产成本，并且得到光学纯度较高的L-5-甲基四氢叶酸。因此，本课题希望通过生物合成手段改善化学合成的不足。
生物合成途径中关键酶的过表达是代谢工程中提高代谢产物常用的策略，本课题正是利用此策略构建L-5-甲基四氢叶酸高产菌株，为生物法合成提供一个新思路。
本课题在原有菌种的基础上，用基因工程的方法对原菌种进行改造，构建具有潜在应用价值的高产L-5-甲基四氢叶酸菌株，找到一条以生物法合成L-5-甲基四氢叶酸的新途径，为我国L-5-甲基四氢叶酸生产事业的发展奠定一定的理论基础，为以后同类型的研究工作提供相关的数据和经验，从而加快我国L-5-甲基四氢叶酸的产业化，对我国L-5-甲基四氢叶酸产业的发展起到一定的推动作用。
二．文献综述
研究背景：
L-5-甲基四氢叶酸又名(6S)-5-甲基四氢叶酸，它的化学名称为(6S)-N-[4-[[(2-氨基-1,4,5,6,7,8-六氢-4-氧-5-甲基-6-喋啶基)甲基]氨基]苯甲酰]-L-谷氨酸。L-5-甲基四氢叶酸是黄白色或者米色粉末，微溶于水（20℃时的溶解度约为1.07g/100gH2O），几乎不溶于有机试剂。它的化学性质活泼，易氧化，在紫外照射下或暴露与空气中极易被氧化。
L-5-甲基四氢叶酸是叶酸最具生物活性和功能的形式，L-5-甲基四氢叶酸是一种重要的营养因子，在人的生命活动中起着不可或缺的作用。普通叶酸只有转换为L-5-甲基四氢叶酸才能参与甲基化过程以及DNA合成。它是人体血浆和细胞内的游离叶酸存在的唯一形式；也是唯一可以穿透血脑屏障的叶酸类药物，L-5-甲基四氢叶酸是体内重要的甲基供体，可参与体内多个生化反应，在人体的生命活动中起着重要的作用。L-5-甲基四氢叶酸的缺乏与多种疾病相关。例如对阿兹海默症就有很好的防治作用[1~3]。此外它还可以与抗癌药物甲酰蝶呤等配伍使用，降低抗癌药物的毒副作用。L-5-甲基四氢叶酸也被用于巨幼红细胞性贫血、风湿性关节炎，心血管等疾病的治疗。美国、日本和欧洲已经批准将L-5-甲基四氢叶酸上市，作为一种食品添加剂添加到各种食品中，使得L-5-甲基四氢叶酸的市场需求量剧增。
本研究就是将菌体内L-5-甲基四氢叶酸合成途径中的两个关键酶5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶和二氢叶酸还原酶作为研究对象。首先利用PCR方法从E.coliBL21中克隆出5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的基因metF，并成功构建重组菌BL21-pET-22b-metF，并对野生菌和重组菌内L-5-甲基四氢叶酸的含量分别进行了测定。结果表明L-5-甲基四氢叶酸的含量较野生菌有所提高，但效果不甚明显。
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