开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 研究背景
近年来心脑血管疾病发病率呈逐年增高趋势, 其高致残率和高死亡率对人民健康构成严重威胁并给社会带来沉重负担。血栓是诱发心血管疾病最直接的因素。目前临床常见的用来防治血栓的药物主要分为3类: 抗血小板药物、抗凝血药物和溶解血栓药物。这些药物作用方式各异，但均有较高的出血风险。研究表明，凝血因子XI(factor XI,FXI)是出血风险小的抗栓防治新靶点。目前研究的FXI抑制剂主要包括小分子抑制剂、反义寡核苷酸类、多肽以及抗体等。FXla蛋白类抑制剂多含Kunitz型结构域。Kunitz型结构域能够有效抑制FXla的活性，从而使蛋白类抑制剂在凝血系统和血栓形成中发挥重要作用。本实验室已从水蛭天然活性组分中发现新型Kunitz结构域的FXla蛋白类抑制剂WPK5，并对其进行序列优化改造命名为WPK5-mutant。
- 凝血因子XI的结构
FXI是一种产自肝脏的丝氨酸蛋白酶原, 单体分子质量在80 kD左右, 同源二聚体分子质量为160 kD。人FXI和血浆前激肽酶的氨基酸序列具有58%的相似性。该蛋白由二硫键连接的 2 个完全相同亚基构成,其中每条多肽链上含607个氨基酸。每个亚基分为重链 (N 端催化区域) 和轻链 (C 端催化区域), 其中重链为 4 个 AP 结构域 (apple domain, A1～A4)。在凝血瀑布中, 4个 AP结构域是 FXI与其他分子相互作用的部位：A1 结合凝血酶; A2 结合高分子量激肽原(HK); A3 结合凝血因子 IX (factor IX, FIX)、糖蛋白 Ib和肝素; A4结合活化的凝血因子 XII (FXIIa)。4个 AP结构域并列形成中央有空腔的杯碟状平台, 这个空腔主要由碱性和带正电荷的芳香性侧链组成。基于4个AP 结构域形成的“杯与碟”结构更加利于 FXI 的催化功能。
- 凝血因子XI的作用机制
1964年Macfarlane发表了关于凝血级联系统的假说, 内外源凝血途径得以修正, 人们关于凝血系统的认知得到进一步的改善。凝血级联反应的初始是由损伤血管壁暴露的组织因子(外源途径)或者活化的FXII因子(内源途径)触发的。外源途径中最强的激动剂是暴露在损伤血管壁上的组织因子, 在病理条件下, 组织因子会结合FVIIa形成复合物然后催化FX的活化, 接下来FXa会切割凝血酶原产生凝血酶进一步引起凝血。当血液暴露在阴离子表面或者粗糙表面时, 凝血酶和纤维蛋白会通过一系列反应而产生, 这个过程被称为接触激活。接触激活系统中包含2个关键的酶原(前激肽释放酶和FXII)和1个辅因子HK。FXII与多阴离子化合物结合会触发 FXII 的自我活化产生 FXIIa，FXIIa在HK存在时催化前激肽释放酶(PK)转化为激肽释放酶(KK), 同时KK会活化更多的FXII。FXIIa在HK帮助下进一步活化FXI产生FXIa，FXIa可激活FIX产生FIXa。最后FIXa偶联凝血因子VIIIa触发凝血因子X的活化和凝血酶的产生。FXI 也可以通过凝血酶来反馈激活, 两者相互作用, 加快形成纤维蛋白。
研究表明, FXIa也可以水解组织因子抑制剂从而促进外源途径的激活。 在这个过程中, 血小板也辅助FXIa参与止血。有趣的是, 独立于FXIIa和接触激活途径, 血小板依赖的多聚磷酸可以增强FXI的活化, 并且短链的polyP能够增强FXIa 钝化组织因子途径抑制剂(TFPI)的能力, 这进一步证明了血小板polyP和FXIa在止血过程中的联合作用。因此, FXI在凝血系统和血栓形成中扮演着关键的角色。
- 凝血因子XI抑制剂 体内FXI放大路径对正常止血必要性不大, 但对血栓形成有更重要的作用, 新抗凝方案探索的目光聚焦到FXI。目前已发现的抑制剂主要包括ASOs、小分子抑制剂和蛋白类抑制剂等。
- 重组多肽WPK5-mutant
从水蛭中鉴定出五个Kunitz型肽，用毕赤酵母GS115表达重组蛋白，命名为WPK1-WPK5。将WPK5中的环1 ( TGPCRSNLER )和环2 ( QYGGC )分别替换为PN2KPI中的环1 ( TGPCRAMISR )和环2 ( FYGGC ),得到WPK5 - mutant。WPK5 - Mut在体外表现出良好的抗栓活性。
二．拟研究或解决的问题
本项目拟在前期基础上，采用生物技术手段，通过毕赤酵母GS115对WPK5-mutant大量表达，但重组蛋白的表达量较低；本实验将从培养基pH、诱导物甲醇的添加量、接种量、装液量等方面进行探究，旨在探索WPK5-mutant 250mL摇瓶发酵的最优条件的来提高目的蛋白的表达量；结合多种纯化手段将其纯化并进行验证。
- 实验方法
- 培养基配制
a)YPD:1%酵母粉，2%蛋白胨121，2%葡萄糖（固体培养基加1.5%琼脂）
b)BMGY:1%酵母粉，2%蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液（pH6.0），1.34%YNB，4times;10-5%生物素，1%甘油
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