开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 课题拟解决的问题
DNA聚合酶beta;(polbeta;) 是参与DNA修复过程中碱基切除修复的重要参与蛋白，而目前发现的三种Polbeta;中，R137Q是Polbeta;的甲基化位点，可能对肿瘤的发生有一定的影响和联系。另一方面，DNA损伤可能是生物时钟的一种授时因子，外界环境中DNA损伤的诱因（如一些物理性或化学性的基因毒性刺激）可能引起生物时钟的节律改变。但整体而言，DNA损伤反馈影响生物时钟的相关机制还未得到系统的研究，两者整合调控机制的阐明将进一步丰富目前对生物时钟调控网络的认识，并为治疗相关疾病提供新的药物靶点和方案。
我们希望通过一些研究，能把目前生物学研究的热点问题，包括BER途径、生物时钟、表观遗传修饰、肿瘤发生发展等有机联系起来，进而从时间生物学的角度为肝癌的精准化治疗提供全新的理论依据和实验证据。
二、研究方法和技术路线
1.探究Polbeta; R137Q 突变小鼠的生物节律变化
观察生物时钟基因表达异常的Polbeta; R137Q 突变小鼠的生物节律性变化。购买Polbeta; R137Q 突变小鼠和对照的WT小鼠，适应一周后，记录15天不同环境下的小鼠活动情况（转轮圈数）。在24小时内每隔4小时取一批小鼠的血液和组织样品。提取RNA和蛋白，通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹的方法，得到在不同时间点的重要时钟基因的表达节律。最后通过和WT组小鼠比较，得出Polbeta; R137Q 的突变对时钟基因表达的影响。
2.探究Polbeta; R137Q 突变调节 Per1 表达的分子机制
我们假设Polbeta; R137Q 突变会影响BER途径，降低其去甲基化的能力，阻碍靶基因的转录，所以通过分析在测序结果中表达量降低的4个时钟基因的甲基化位点CpG岛的信息，来研究Polbeta; R137Q 对启动子甲基化水平的影响。具体使用MeDIP实验（提取小鼠原肝，取其基因组，超声使基因组断裂成片段后用Anti-5mc交联过夜后进行IP试验，再进行解离和纯化DNA，最后进行qPCR检测。）BSP试验（提取小鼠原肝，取其基因组，加入亚硫酸氢盐，再进行DNA的纯化，PCR扩层，T载体孵化过夜，再蓝白斑筛选和测序分析。）再使用免疫共沉淀法测定甲基化位点CpG岛的锚定情况（打碎小鼠原肝，放入超声仪，得到断裂的DNA，再使用Polbeta;的抗体和PCNA的抗体进行反应，再通过设计的引物检测CpG岛）这些方法测试Polbeta; R137Q 对启动子甲基化水平的影响。
3. 探究Per1 在 Polbeta; R137Q 突变促进小鼠肝癌发生发展过程中的媒介作用
我们利用腺病毒介导的Per1过表达技术探究在Per1对Polbeta; R137Q 突变的作用，通过测试回补了Per1的HuH7-R137Q细胞株的细胞生理数据，以及在马血清休克实验中测试这种细胞株中其他相关肿瘤基因的变化情况。
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