β-榄香烯的神经保护作用研究文献综述

课题来源及研究的目的和意义：

缺血性脑卒中又称脑梗死，是由于脑的供血动脉狭窄或闭塞而导致的脑组织坏死。患者脑部神经元、少突胶质细胞受到损伤，引起失语、偏瘫等一系列神经功能缺损症状的发生，致死率致残率高，给患者家庭及社会带来沉重的负担。其治疗主要通过两个途径：一是溶解血栓；二是阻止缺血引起的脑组织一系列的病理及生化反应、防止神经元的死亡，即神经保护治疗。由于时间窗的限制，仅少数患者能获取溶栓的治疗机会，对于不能接受溶栓治疗的患者，如何最大程度的减少神经功能缺损，是一项重大的课题。

醒脑静注射液是由传统名方“安宫牛黄丸”经科学提取精制而成的新型水溶性静脉注射液。其主要成分有麝香、冰片、栀子和郁金等，具有清热解毒、凉血活血、开窍醒脑的功能，能显著抑制炎性反应，挽救缺血半暗带尚具活性的神经细胞，对改善急性缺血性脑卒中患者神经功能有着显著疗效。

beta;-榄香烯是醒脑静注射剂中冰片的主要成分，临床用于肿瘤治疗，具有抗瘤谱广泛，疗效确印，毒副作用轻等特点。但对于其神经保护的研究，目前还处于不断完善中，有关生物活性和分子机制的研究尚未见报道。本实验拟考察beta;-榄香烯对神经元细胞的形态结构、细胞代谢情况和细胞早期凋亡的相关性变化，以期为beta;-榄香烯的神经保护作用以及机制的研究提供参考。

beta;-榄香烯的神经保护作用研究现状与进展

1. beta;-榄香烯研究现状与进展

1.1 药理作用及机制

（1）抗肿瘤作用：1）调控基因的表达：抑制细胞周期调节蛋白E、CDK2、CDK6的表达，下调肿瘤细胞中bcl-2的表达，提高细胞凋亡调节蛋白Caspases-3活性，从而使细胞周期停滞在G1期，此外还能通过阻滞细胞周期、影响酶的活性等方式诱导细胞凋亡。2）抑制肿瘤细胞迁移和侵袭：可显著抑制B16细胞对纤维结合蛋白和粘连蛋白的黏附，抑制B16细胞的运动。3）抑制肿瘤血管生成：beta;-榄香烯可直接干扰血管内皮细胞的增殖及细胞周期，阻滞细胞从G1期进入S期及G2期，并降低其成血管能力。

（2）视神经保护作用：Zhang等^[1]在对将beta;-榄香烯作为视神经保护剂的研究中发现，beta;-榄香烯可以抑制Th1细胞和Th17细胞的极化，促进调节性T细胞的表达，通过调节免疫平衡发挥作用。

1.2 体内过程

ip beta;-榄香烯后，药物在脂肪组织中含量最高，药物从脂肪组织中缓慢释放入血，血浆消除半衰期较长。易通过血脑屏障而分布于脑内，beta;-榄香烯从呼吸道排出以及在体内的生物转化可能是其重要的消除途径，经尿、粪、胆汁排泄不是其主要消除途径^[2]。

2 其他倍半萜类药物有关神经保护作用的研究进展

2.1 石杉碱甲对脑缺血损伤的保护作用

通过氧糖缺乏(oxygen-glucose deprivation，OGD)培养6小时再含糖含氧培养6小时诱导大鼠神经胶质瘤细胞株C6细胞损伤，Ikappa;Balpha;的磷酸化并降解，激活核转录因子-kappa;B(nuclear factor-kappa B，NF-kappa;B)，从而导致诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)、环加氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)以及一氧化氮(nitric oxide，NO)的过量表达。石杉碱甲可抑制NF-kappa;B的激活，下调iNOS、COX-2的蛋白量以及NO的含量，同时明显抑制AChE的活性，发挥神经保护作用，显著缩小脑梗死的范围^[3]。

2.2 芍药苷对脑缺血损伤的保护作用

芍药苷能够减轻脑缺血动物模型造成的神经损伤。研究发现，其通过激活Akt和ERK1/2信号通路，发挥神经营养因子样作用。在原代皮层神经元和HEK293/A1R细胞上，PF激活下游Akt和ERK1/2信号通路，并依赖腺苷A1受体转移激活EGFR，介导其抗缺氧缺糖的神经保护作用^[4]。

2.3 beta;-石竹烯对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

beta;-石竹烯是冰片中另一种倍半萜类成分，研究表明，在大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型中，采用双盲法进行神经行为学评分；TTC染色法测定脑梗死体积；透射电镜(TEM)和尼氏染色法(Nissl)观察海马神经元病理变化；原位末端凋亡法(TUNEL)检测海马神经元凋亡情况；测定MCAO大鼠海马中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、脂质过氧化物(LPO)含量；Western法和定量PCR法检测Nrf2及HO-1蛋白及基因的表达。结果表明，beta;-石竹烯能改善MCAO大鼠神经行为学障碍，减少脑梗死面积，可减轻海马神经元病理缺损及细胞凋亡情况；使SOD、CAT活性明显降低，MDA、LPO、NO含量明显增多；Nrf2、HO-1蛋白及基因的表达明显增多。因此beta;-石竹烯对脑缺血再灌注大鼠具有神经保护作用，此作用可能与调控Nrf2/HO-1通路有关^[5]。

3 神经保护作用及机制的研究进展

3.1阻断钙离子通道

发生缺血性脑卒中时脑组织处于能量剥夺状态，引起细胞膜能量依赖性离子通道或离子泵失活，从而导致膜电位发生去极化。突触前膜电压依赖性钙离子通道被激活并释放兴奋性氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸，最终产生细胞兴奋性毒性作用，使细胞内钙离子、钠离子和氯离子浓度以及水增加，进一步加重神经元损伤。因此，钙离子通道阻断剂通过抑制钙离子内流可以减少神经元突触前膜兴奋性氨基酸的释放和细胞内钙超载，而且可使脑血管扩张、脑血流量增加，在缺血性脑卒中的治疗中发挥重要作用^[6]。

3.2 抗氧化

氧化应激与脑缺血的病理生理过程密切相关^[7]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）和自由基（包括超氧阴离子、羟自由基和过氧亚硝基）在发生缺血性脑卒中后大量产生，并进一步导致炎性反应、细胞凋亡和组织损伤。正常情况下，这些自由基可以被过氧化物酶清除；但发生缺血性脑卒中时，自由基产生和清除之间的平衡被破坏，最终导致脑损伤。近年来，研究者们对以缺血性脑卒中氧化应激的病理生理过程为靶点的神经保护药物进行了探索。如：自由基清除剂、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路激动剂、一氧化氮合酶等。

3.3 抗炎

炎症在脑缺血损伤过程中有重要作用。发生缺血性脑卒中后，缺血局部脑组织白细胞聚集和小胶质细胞激活导致多种促炎细胞因子产生。小胶质细胞在大脑炎症中，尤其是在缺血半暗带内起着重要作用。此外，发生缺血损伤后内皮细胞、星形胶质细胞和神经元也会分泌促炎细胞因子。这些炎性细胞和促炎细胞因子共同作用导致神经元进一步损伤。因此，抗炎药物也可能是治疗缺血损伤的重要方法之一。

3.3.1抑制促炎细胞因子

脑缺血损伤后小胶质细胞和其他炎性细胞激活并分泌促炎细胞因子，加重脑损伤。在这一过程中，核因子-kappa;B（nuclear factor-kappa;B，NF-kappa;B）等转录因子将被激活，导致炎性因子增加。研究发现，雷公藤甲素以 NF-kappa;B 为靶点发挥抗凋亡活性，它通过下调 iNOS、环氧合酶 2（cyclooxgenase 2，COX-2）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和 NF-kappa;B 的表达，对MCAO模型大鼠具有抗炎和神经保护作用^[8]。钙通道阻断剂也可通过降低促炎细胞因子白细胞介素-1、肿瘤坏死因子alpha;、IL-6和干扰素gamma;的mRNA表达水平，从而缓解 MCAO 模型小鼠的神经功能缺损^[9]。

3.3.2 激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）

AMPK 激活剂可以显著减轻炎性反应，并抑制各种脑缺血模型中的炎症损伤^[10]。

3.3.3 阻断趋化因子受体　

研究表明，抑制 CXC 趋化因子受体 4/7（chemokin CXC motif receptor 4/7，CXCR4/7）通路能显著改善脑缺血后的神经功能，并逆转免疫反应。

3.3.4 抑制细胞凋亡

脑缺血导致的细胞凋亡是导致神经元死亡的主要原因之一。缺血相关凋亡因子包括 B 细胞淋巴瘤/白血病2（Bcl-2）蛋白家族和 caspase 蛋白酶家族，以及p53、NF-kappa;B、PI3K/Akt 和 AMPK。Bcl-2 家族和caspase 家族在细胞凋亡调控中扮演着重要的角色，二者平衡对凋亡起到关键性调控作用^[11]。

小结

研究表明，冰片beta;-石竹烯以及其他倍半萜化合物具有神经保护作用，冰片中beta;-榄香烯是否也具有类似作用，未见报道。目前，有关神经保护的作用及机制研究较多，是否beta;-榄香烯具有神经保护作用，值得深入研究。

参考文献

1. Zhang R, Tian A, Shi X, et al. Downregulation of IL-17 and IFN-gamma; in the optic nerveby beta-elemene in experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Int Immunopharmacol, 2010, 10: 738-743
2. 王堃, 苏成业. beta;—榄香烯在大鼠体内的药代动力学及体内过程[J]. 药学学报, 2000, 35(10):725-728.
3. 周瑾.石杉碱甲对缺血性损伤的神经保护作用及分子机制研究[D].中国科学院上海药物研究所,2002:103页.
4. 钟敏. 天然产物芍药苷神经保护作用的机制研究[D]. 2012.
5. 曹光秀. beta;-石竹烯通过抗氧化作用减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤[D].
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7. Q I A N Y, TA N G X , et al. Neuroprotection by combined administration with maslinic acid, a natural product from olea europaea, and MK-801 in the cerebral ischemia model[J/OL]. Molecules, 2016, 21: E1093. doi: 10.3390/molecules21081093.
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9. PAN N, LU L Y, et al. Xyloketal B alleviates cerebral infarction and neurologic deficits in a mouse stroke model by suppressing the ROS/TLR4/NF-kappa;B inflammatory signaling pathway[J]. Acta Pharmacol Sin, 2017, 38: 1236-1247.
10. 梅莎莎. AMPK激活剂AICAR在老龄小鼠短暂性脑缺血/再灌注中的作用[D]. 2015.
11. 曹贵方, 毕齐. 缺血性脑卒中神经保护治疗的临床研究进展[J]. 中华老年心脑血管病杂志, 2013, 15(8).

1 过氧化氢诱导的神经元细胞损伤模型的建立

过氧化氢（H₂O₂）是一种活性氧成分，在体内可转变成细胞毒性极强的 · OH，是机体自由基产生的重要环节，自由基损伤所造成的细胞凋亡是组织缺血引起损伤的重要环节。造成的细胞损伤主要表现为细胞活性降低，细胞膜完整性破坏，LDH释放增加，线粒体肿大等。人神经母细胞瘤株细胞系是一种分化程度较低的肿瘤细胞，该细胞繁殖快，细胞形态、生理和生化功能与正常神经细胞相似，被广泛应用于神经系统疾病发病机制和药物作用机制方面的研究。本实验采用H₂O₂制备N2a细胞氧化损伤模型，观察不同浓度beta;-榄香烯对神经细胞的损伤的抑制作用。

2 CCK-8测细胞毒性

Cell Counting Kit-8，是一种基于 WST-8 而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。WST-8 在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅 (生成的formazan量)和细胞数目呈线性关系。

2.1 细胞增殖-毒性检测

取同一代N2a细胞，待细胞生长至亚融合状态时，随机分为5组：正常组、H₂O₂ 损伤组、beta;-榄香烯高浓度组、中浓度组、低浓度组。各用药组给予相应浓度的药物，然后进行相应指标测定。

2.2 计算公式

细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] times; 100%

抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] times; 100%

As: 实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液) ；

Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物) ；

Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物) 。

3 形态学观察

在显微镜下进行细胞形态观察。

4 乳酸脱氢酶（LDH）漏出率的检测

LDH是一种稳定的蛋白酶，存在于正常细胞的胞质中，正常情况下不能透过细胞膜，当细胞受到损伤时，细胞膜通透性增加，LDH即被释放到细胞外。乳酸脱氢酶活性测定：按LDH测定试剂盒说明书操作，比色法测定细胞培养液中LDH的OD值并计算其活性。

5 线粒体膜电位检测

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)以JC-1为荧光探针，可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化，线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

6 活性氧的测定

活性氧(ROS)是指由氧形成的、具有未配对电子的氧原子或原子团，通常包括超氧阴离子、过氧化氢等多种形式，在机体内具有很强的氧化反应能力，易与各种生物大分子发生反 应而导致细胞和组织氧化损伤。脑缺血时可产生大量 ROS，后者可通过多种途径损伤神经细胞，通过活性氧的测定可考察beta;-榄香烯是否可通过清除ROS抑制这些损伤。

7 Western blot

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将获得的蛋白质样品按蛋白分子量的大小进行分离，将分离后的蛋白质转移至固相支持物（PVDF膜）上，用抗靶蛋白的特异性抗体（一抗）与膜上的靶蛋白进行结合，应用二抗及荧光染料 ECL对抗原抗体复合物进行标记，最后分析最终图像，研究beta;-榄香烯对H₂O₂诱导的N2a细胞凋亡相关蛋白的影响。