一、研究背景
血管内皮细胞损伤参与了多种心脑血管疾病发生发展的病理过程，血管内皮细胞氧化应激损伤和功能的异常是动脉粥样硬化（AS）发生的核心环节，内皮细胞产生的NO具有扩张血管的作用。同时，通过抑制血小板的聚集、白细胞的粘附、减少氧自由基的产生等起到抗AS作用。内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）是NO产生的关键酶。当细胞受到外界信号刺激时，eNOS与小凹蛋白（Cav-1）分离，eNOS被激活，从而产生NO。内皮细胞损伤模型是阐明内皮损伤机制、筛选内皮保护药物的重要工具。目前，用于损伤模型制备的内皮细胞主要有原代培养的内皮细胞和内皮细胞株两类。前者是来源于实验动物（鼠、牛、猪等）或者人的血管（如主动脉、冠状动脉、脑动脉、肺动脉、脐静脉等），需原代分离培养，在体外只能传非常有限的代数。其中，最为常用的是人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）。引起内皮损伤的因素众多，机制与病理意义各异。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、末端晚期糖基化终末产物（AGEs）、过氧化氢（H2O2）、同型半胱氨酸（Hcy）、血管紧张素II（Ang II）等已被成功应用于建立内皮细胞损伤模型。川芎嗪具有抗AS作用，本研究通过同型半胱氨酸（Hcy）诱导内皮细胞损伤的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）模型，观察不同浓度下的川芎嗪对Cav-1和NO系统的变化。
1、研究现状和进展
研究认为高血压时VEC损伤，其受损程度与高血压的严重程度呈正相关，经抗高血压治疗，内皮功能可以得到改善。VEC分泌的ET与NO的失衡在高血压的发生发展中起着重要作用。在原发性高血压（EH）患者及实验性高血压动物，均发现血浆NO水平较对照组低，其降低水平与高血压程度相关，在中、重度高血压病人的阻力血管其内皮细胞NO相关基因表达降低，均说明高血压时NO的合成、释放、生成减少。体内血管内皮细胞还存在凋亡现象，有研究表明覆盖在血管壁的凋亡细胞影响EC再生，使血管壁受损，促进高血压的发展。在许多体外实验和已建立的动物模型中表明内皮细胞凋亡可能成为血压升高的一个重要过程
同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）是一种含硫基的氨基酸，它是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的一个重要中间产物，其本身并不参加蛋白质的合成。同型半胱氨酸在正常人血浆中的浓度较低，通常为5.0-16uM。体内同型半胱氨酸浓度高于正常值为高同型半胱氨酸血症，大量流行病学调查和临床病例研究已证实，血中同型半胱氨酸的浓度升高是独立于其它已知危险因素的致心血管疾病危险因子[1]。运用HCY模拟了高同型半胱氨酸血症患者引发高血压等心血管疾病的发病机制。更有利于进行血管内皮细胞保护作用的研究，特别是一些中药组分和提取物对内皮细胞损伤的保护作用。
目前已证实，HCY在生理浓度铜离子存在下可能通过氧化应激损伤的机制而导致血管内皮细胞凋亡。氧化应激与细胞凋亡密切相关。当细胞内源性或外源性活性氧(ROS)水平升高，超过其抗氧化体系的还原能力时，可以使细胞处于氧化应激状态。活性氧包括超氧自由基、过氧化氢及其下游产物过氧化物和经化物等。活性氧可以损伤DNA分子[2]、导致聚ADP核糖转移酶活化[3]、引起细胞脂质过氧化[4]、促使细胞内Ca2 水平增加，以及通过调节细胞凋亡相关基因等[5]。此时，血管内皮细胞发生肿胀、通透性增加，而且内质网内合成的颗粒增多，表明内皮的形态和功能都已发生改变，认为内皮（EC）已被“激活”。Hcy对HUVEC增殖活性的影响具有剂量依赖性[6]。
EC激活后可释放多种血管活性物质，促进或抑制内皮的损伤。内皮衍生血管舒张因子(EDRF)，目前认为即是一氧化氮(NO),L-精氨酸(L- Arg)在一氧化氮合酶（NOS）催化下产生NO，激活鸟苷酸环化酶(GC)产生更多环磷酸鸟苷(cGMP)而介导平滑肌舒张，在心血管疾病发生发展中，NO生成减少标志的内皮细胞功能失调被认为是关键性的第一步;内皮素-1(endothelins-1,ET-1)在生理情况下，对全身血管阻力及容量调节，尤其对微循环调节起主导作用，常以此作为内皮细胞激活标志物;前列环素(PGI2)，血液或血管内皮中花生四烯酸经环氧合酶途径生成前列腺素H2(PGH2)，后经血管壁细胞前列环素合成酶作用生成PGI2, PGI2可抑制血小板聚集、扩张血管和促进纤溶、保护内皮细胞。
NO是1980年Furchgott等发现的一种血管内皮舒张因子(EDRF),1987年由Palmer等证实该EDRF的化学本质为NO，大量研究表明,NO在心血管、免疫、神经、消化等系统中具有重要的调节作用[7]。一氧化氮合酶(NOS)是NO合成的催化酶,由于NO具有广泛而重要的生理和病理学功能,使得NO,NOS的研究已经成为现今生命科学研究的热点之一。
NO是一种气体自由基,分子中有一未配对电子,可形成自由基,和其它分子如氧分子、超氧自由基,或过渡金属(如与haemoproteins血红蛋白结合的铁)反应。在体内极不稳定,是一短寿分子,半衰期仅为3-5s。NO具有脂溶性,可以快速透过生物膜扩散,在体内迅速被血红蛋白、氧自由基或氢醌等灭活。
NO由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸与氧分子经多步氧化还原反应生成。不同类型的细胞中,存在不同类型的NOS,通过不同的信号转导机制产生NO。NOS是NO合成过程中的关键酶,由于NO性质活泼,半衰期短,因此许多关于NO的研究都集中在NOS的研究上。现已知NOS有3种类型,可以广义的将其分为两种,即构成型一氧化氮合酶(cNOS)和细胞因子诱导型(iNOS或NOS2)。cNOS包括内皮组织(eNOS或NOS3)和神经系统(nNOS或NOS1)。它们在组织分布、调节方式、生物活性和NO产生量方面都有区别。cNOS主要分布在内皮组织(eNOS)和神经系统(nNOS),主要负责基础NO的合成,调节各种生理功能[8]。它们依赖Ca2 的存在,当细胞内Ca2 浓度升高时被激活。cNOS合成小量的、短期的NO,引起NO浓度的快速增加,而当Ca2 浓度减小时,NO量迅速下降,形成一个博动性的NO释放,这是生理调节所必须的NO。eNOS是膜结合型的,在血管紧张度控制和血小板凝集中有一定的作用,nNOS是细胞溶质的,发挥神经递质作用,在人的骨骼肌里已经发现了它的mRNA。iNOS在多种细胞中均有表达,iNOS不仅在免疫反应细胞如巨噬细胞和中性粒细胞中表达,而且在多种哺乳动物细胞,包括成纤维细胞、角质化细胞、内皮和血管平滑肌细胞,以及非哺乳动物,包括昆虫和植物中均有表达。iNOS是非Ca2 依赖型,其激活不需要Ca2 浓度升高。iNOS在静息细胞内是不表达的,当细胞受到细胞因子或免疫微生物刺激,如革兰氏阴性杆菌的脂多糖LPS强烈诱导,iNOS催化合成非生理浓度的大量NO,产生一系列病理作用。
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