肺炎支原体蛋白重组表达及纯化文献综述

开题报告内容：

一、课题解决的问题

肺炎支原体（mycoplasma pneumonia）通过飞沫传播，侵入机体后可引发呼吸系统感染，包括原发性非典型肺炎、支气管炎、咽炎和喉炎等，且可引起支原体脑炎、心肌炎、关节炎、皮肤损害等多系统并发症。肺炎支原体肺炎占社区获得性肺炎的5% - 40%，且主要引起青少年感染。支原体（mycoplasma）是一类介于病毒和细菌之间，能在人工培养基中自行繁殖的最小原核生物。Mp基因组仅有816 kp，为大肠埃希菌的1/5-1/6，其代谢能力差，不具备细胞壁，亦不产生内毒素，Mp与肺上皮纤毛细胞的密切接触对于局部组织的损伤和细胞毒作用至关重要，是其致病的关键。由P1蛋白、P30蛋白、P116蛋白、HMW1-3、P65蛋白等构成的黏附蛋白复合体是决定Mp 黏附能力的细胞器。由于缺乏新的重组和纯化方案使得相关研究进展缓慢。

本课题应用基因重组技术和带组氨酸标签的融合表达系统建立了融合蛋白的重组表达载体，经由大肠杆菌获得了高效表达融合蛋白，并利用亲和层析蛋白纯化技术进行提纯，探究高效的表达纯化路线。

二、研究方法和技术路线

利用研究所已有条件，通过基因重组技术和带有组氨酸标签的镍离子交换柱进行表达和纯化操作，实现高效的筛选表达纯化工作。

主要的技术路线如下：

接菌→质粒提取→核酸电泳→制备感受态细胞→转化→挑单菌落→扩大培养→IPTG诱导→离心→超声破碎→离心→电泳→胶吸附→洗脱→电泳。

三、论文课题研究进度安排

2013年2月27日----3月10日 确定选题，查阅文献。

2013年3月10日----3月18日 撰写开题报告。

2013年3月18日----4月1日 进行调查、收集资料、进行分析设计。

2013年4月1日----5月15日 进行实验操作，并提交论文初稿。

2013年5月20日前 修改论文，完善系统

2013年5月30日前 提交正式毕业设计以及相关成果，并进行论文答辩准备。

四、文献综述

支原体是细胞外寄生菌,属暗细菌门,柔膜纲,支原体目,支原体科(Ⅰ、Ⅱ),支原体属(Ⅰ、Ⅱ)。支原体广泛寄居于自然界,迄今已发现的支原体有60余种,可引起动物、人、植物等病害。自人体已分离出13种,其中8种较常见。目前肯定对人致病的支原体有3种,即肺炎支原体、解脲支原体及人型支原体。肺炎支原体是人类原发性非典型肺炎的病原体^[1]。肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）没有细胞壁结构，仅由胞膜包裹的，是一种能自主复制的最小单位的原核生物。肺炎支原体细胞膜表面具有多种特异性的膜抗原和胞浆抗原。MP主要通过飞沫传播，侵入机体后可引发呼吸系统感染，包括原发性非典型肺炎、支气管炎、咽炎和喉炎等，且可引起支原体脑炎、心肌炎、关节炎、皮肤损害等多系统并发症^[2]。肺炎支原体肺炎占社区获得性肺炎的5%-40%，且主要引起青少年感染^[3]。是儿童社区获得性肺炎(CAP)最重要的病原之一^[4]。

肺炎支原体的基因组是环状双股DNA，其基因组测序已完成，G C含量为40%，共有689个开放阅读框（ORF）^[5]。MP缺乏细胞壁，因而beta;-内酰胺类抗生素对其无效。其他抗生素如四环素、喹诺酮类、氨基糖苷类及大环内酯类抗生素通过干扰和抑制蛋白质合成而发挥作用^[6]。但因为氨基糖苷类药物具有明显的耳毒性和肾毒性，喹诺酮类可引起软骨损害，对骨骼发育有影响^[7]。肺炎支原体的发病机制被部分归因于过度的免疫反应，其通过黏附蛋白黏附到相关细胞表面，激发某种信号从而引起特异性细胞骨架的蛋白重排，穿过胞膜并在胞质中大量复制，最终导致宿主细胞受损与死亡^［8］。近Hahn等发现MP通过其表面P1蛋白粘附于宿主细胞而产生致病作用^[9]。P1蛋白是MP膜表面蛋白,具有粘附作用^[10]。试验表明,MP的170 KD、71 KD和23 KD多肽免疫抗原性较强,其中170 KD多肽可能是MP主要致病物质粘附因子P1蛋白^[11]。P1蛋白粘附于呼吸道上皮细胞是MP繁殖和致病的先决条件,P1蛋白在介导粘附过程中具有重要作用。在MP感染的急性期和恢复期均可测到血清P1蛋白抗体^[12]。

P1黏附蛋白与黏附相关蛋白P30和40、90kDa的膜蛋白串联在一起,是Mp有效黏附于宿主细胞所必需的^[13]。通过克隆重组基因片段，构建重组质粒pGEX，可在大肠杆菌内获得稳定表达融合蛋白,通过免疫印记杂交证实了表达的59kDa融合蛋白具有免疫反应性^[14]。镍柱是有效分离蛋白的方法之一，镍柱中的氯化镍可以与组蛋白标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合，通过与蛋白结合后用咪唑洗脱，有效的分离纯化了蛋白质，更易得到纯化的蛋白样品^[15]。

参考文献：

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15蛋白纯化手册[M]