益气复脉粉针剂对过氧化氢损伤的大鼠脑皮层原代神经元调节作用研究文献综述

研究

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

拟研究或解决的问题：

本课题拟考察益气复脉粉针(YQFM)能否对过氧化氢损伤的大鼠脑皮层原代神经元发挥保护作用，并初步探讨其可能的调节机制，为进一步扩展其临床应用提供实验依据。

采用的研究手段：

（1）大鼠皮层原代神经元的培养

妊娠16天的SD大鼠颈椎脱臼处死，置于75%乙醇中浸泡一分钟，剪开大鼠肚皮，使用弯钳和锋利的尖镊子，小心撕破胚囊取出胚胎，最好从胎盘的反面撕裂，如果胚胎不出来，可以从条腿或尾巴拉出。然后置于预冷1PBS中，随机转移至生物安全柜75％乙醇中浸泡一分钟，最后转移到配好缓冲溶液1中。将胚胎取出并放置于大的培养板上。用弯钳固定胚胎，同时用尖镊子剥离头部覆盖的皮肤，用另一把尖镊子从脑中缝上破开脑壳，用黑柄刮铲遮挡小脑并仔细去除皮质，将皮层放置在含有溶液（1X）的小培养皿中。丢弃培养板上的胚胎，对所有胚胎重复该操作。将含有皮质的培养皿置于解剖显微镜下，并确保皮质平铺在培养皿中，用无菌钝头镊子和双头刮铲分裂脑半球并取出新大脑皮层，剥除大脑皮层的脑膜。将干净的新大脑皮层分别置于含有溶液（1X）的单独的培养皿。所有皮层重复此过程。显微镜相下操作均应确保皮质处于低温状态。将剥好的皮层置于胰酶消化液中，37度消化25min后加入终止液终止消化，并1000r,5min离心。弃上清，加入DNA酶I和大豆蛋白酶抑制剂混合溶液吹打数次，再加沉降缓冲液，静置5min,取上清。并重复上述操作一次。合并上清液，1000r，5min离心，弃上清液，加适量配好neurobasl培养基，计数，接板。培养两天后，加入有丝分裂抑制剂ARA-C。细胞生长至第六天，9天时，细胞半换液。

（2）MTT法测定神经元细胞活力

原代细胞按密度为1x106个/ml接种于96孔板中，每孔100ml。细胞生长至第六天时细胞半换液，给药。实验分组：实验分组a.空白组：换液后正常培养，不做处理；b.模型组：细胞换液后先培养6h，再加入H2O2使其终浓度为100Mu;，刺激12h；c，d,e分别依次为YQFM给药组：细胞换液后先加入不同剂量的YQFM(100mu;g/ml,200mu;g/ml,400mu;g/mL,培养6h，再加100Mu;H2O2刺激12h；f.阳性药(NAC)组：先加入含一定浓度(500M)阳性药的NAC培养6h，再加100MH2O2刺激12h。

去除培养液→加入MTT工作液→培养箱中孵育3~4小时→去除染色液→加入150mu;LDMSO→振荡10min使结晶溶解→酶标仪(双波长570-650nm处)测定每孔的OD值。

（3）Caspase3活力检测

依照碧云天caspase-3活性检测试剂盒所提供的方法进行实验。各组细胞弃去培养基，预冷PBS洗涤细胞两次，0.25%胰酶消化50s，2000rpm，4℃离心5min收集细胞，小心吸除上清，PBS洗涤一次，吸除上清，按每200万细胞加入100mu;L裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15min，12000rpm，4℃离心15min，将上清转移到预冷的离心管中，加入至96孔板中并与2mM的Ac-DEVD-pNA底物在37C下共孵育4h，使用酶标仪在405nm出测定吸光度值。Bradford法测定上清液中的蛋白浓度。细胞中caspase-3活力的单位采用U/mg蛋白。

（4）Western法测定凋亡相关蛋白的表达

等量加入细胞裂解液后，提取HUVEC细胞的蛋白，4℃裂解30min。离心去上清液。用BCA蛋白试剂盒测定蛋白质的含量。之后剩余的裂解液按1/5的体积加入loadingbuffer煮蛋白。再用10%SDSPAGE分离样品蛋白并转移到PVDF膜，膜由3%牛血清白蛋白(BSA)封闭并且由初级抗体孵化。然后由山羊、兔、鼠的抗体结合辣根过氧化物酶作为次级抗体孵化2h。免疫反应带由化学发光系统(ECLplus,Amersham)检测。

（5）MitoTracker线粒体染色

吸除培养基，预热的DMEM培养基洗一次，加入适量DMEM稀释的MitoTracker染色液，37℃，避光孵育30min。预热的PBS洗三次，然后立即拿去激光共聚焦显微镜拍照。

中药及其有效成分对神经细胞线粒体功能调节的研究综述

摘要：脑缺血缺氧-再灌注损伤,神经退行性疾病如阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、帕金森病、亨廷顿舞蹈病等中枢性神经疾病发生及发展过程中，往往伴随着神经细胞的凋亡，许多促细胞凋亡信号作用于线粒体，改变线粒体结构和功能，诱导线粒体凋亡途径，引起神经细胞凋亡。中药及其有效成分能够从抗氧化、调节线粒体生物合成、维持线粒体动态平衡以及维持线粒体膜电位稳定等多方面发挥线粒体保护作用，现就中药及其有效成分对神经细胞线粒体功能调节作用进行综述。

关键词：线粒体；细胞凋亡；神经细胞；中药

正文：

线粒体作为真核细胞主要供能场所，参与细胞多种生理活动。近年来研究表明，线粒体功能障碍与中枢神经系统疾病密切相关，帕金森病等神经退行性疾病发生过程中，许多刺激因素作用于线粒体，通过损坏线粒体超微结构，破坏其动态平衡，损坏线粒体膜通透性等，导致线粒体功能失常，诱发神经细胞凋亡。中药及其有效成分通过多成分，多靶点作用于线粒体，通过改善线粒体功能从而发挥神经保护作用。先就近几年中药及其有效成分对神经细胞线粒体功能调节研究进展进行综述，拟为中药治疗神经系统疾病提供实验依据。

1.线粒体结构及功能

线粒体(mitochondrion,简称mt)是真核细胞的重要细胞器，是能量产生的主要场所，也在细胞信号调节控和细胞凋亡调节中起重要作用。几乎所有真核细胞的线粒体都有双膜系统:内膜系统和外膜系统，从外向内分为线粒体外膜、膜间。内膜对大部分小离子不通透，从而维持内膜的电化学梯度。外膜上有丰富的空隙形成蛋白可使分子量小于5kD的小分子透过。

线粒体被称为细胞能量加工厂，通过氧化磷酸化为细胞生命活动提供ATP，同时线粒体也是产生活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)的主要场所；此外，线粒体还在调节细胞内钙稳态、钙敏感酶活性及其信号转导中也起重要作用。

在神经细胞中，线粒体的地位尤其重要，这是因为神经元的各项活动需要消耗大量能量，这些能量几乎完全由线粒体提供，当线粒体的氧化磷酸化过程出现障碍时，神经元无法象其它类型细胞一样启动糖酵解功能来补偿。在神经细胞中，线粒体参与调控Ca2 和氧化还原信号通路，突触发育和可塑性，细胞存活和死亡等。线粒体功能障碍与阿兹海默症(AD)、帕金森(PD)等中枢神经系统退行性疾病密切相关[1-2]。

2.线粒体与细胞凋亡

细胞凋亡是机体在生长发育和受到外来刺激时清除多余、衰老和受损伤的细胞以保持机体内环境平衡和维持正常生理活动过程的一种自我调节机制。这种调节机制的异常与多种疾病的发生有关，如老年性痴呆等神经退行性疾病与神经细胞过度凋亡相关[1]。

根据凋亡信号的来源可以将细胞凋亡信号转导通路分成两条:外源通路(死亡受体通路)和内源通路(线粒体通路)。这两条通路最后都汇集于下游的效应Caspase，即凋亡蛋白酶的激活。典型的外在信号通路是:细胞受到外在因素的刺激，启动细胞表面死亡Casapse受体，Fas配体和死亡受体通过细胞和细胞或者受体与配体之间的相互作用形成多蛋白复合体激活caspase8而诱导凋亡；内在信号通路即线粒体凋亡通路，是内部传感器的破坏和细胞应激下的物理化学改变引起Bax活化转运到线粒体外膜使外膜通透性改变继而释放细胞色素C，激活下游的caspase9而诱导凋亡[3]。

线粒体在细胞凋亡中的作用主要表现为：第一,在凋亡发生过程中,多种促进细胞凋亡的蛋白转移至线粒体,从而使线粒体膜的通透性和完整性受到破坏。第二,有多种凋亡诱导因子从线粒体释放,如细胞色素C、AIF和Caspase前体蛋白procaspase-2,-3,-8,-9等在凋亡过程中从线粒体膜间隙被释放到细胞质中，随后引起凋亡。第三,有一些凋亡诱导物能够诱导线粒体上的膜透过性转变孔开放,导致线粒体膜电位消失和释放促凋亡蛋白。第四，对Bcl-2家族蛋白的广泛研究表明，它们主要通过调节线粒体的功能来调控细胞的凋亡[4]。

3.药物对线粒体功能影响

3.1中药抑制线粒体途径的细胞凋亡

中药能够抑制线粒体途径的细胞凋亡。研究发现，银杏内酯和银杏黄酮可以保护TNF-a刺激的大鼠海马神经元损伤，其机制与上调线粒体凋亡途径相关蛋白bcl-2，下调细胞色素C，bax，抑制caspase9活化等有关[5]。中药复方天麻钩藤饮可以有效抑制鱼藤酮诱导损伤的SH5Y-SY细胞线粒体途径的细胞凋亡，从而发挥线粒体保护功能[6]。扎冲十三味丸可以抑制缺血性脑损伤后海马组织神经细胞凋亡，并上调bcl-2蛋白表达，同时下调bax蛋白表达，促进bcl-2同源二聚体形成，通过抑制线粒体凋亡途径从而发挥抗凋亡作用，从而保护神经细胞损伤[7]。应夏丽等用脑中动脉阻断复制急性脑缺血模型，发现哈巴苷各剂量能不同程度改善脑中动脉阻断小鼠大脑缺血区皮层及海马齿状回病理结构及线粒体超微结构变化，减少线粒体水肿。其作用机制可能与保护线粒体损伤、抑制细胞线粒体凋亡途径有关[7]。

3.2中药调节神经细胞氧化应激

李海龙等研究发现，红景天苷作用于百草枯诱导损伤的PC12细胞后，PC12细胞GSH-PX、SOD的活性提高，LDH释放降低，线粒体细胞色素C释放减少，提示红景天苷可以通过抗氧化作用保护神经细胞损伤[9]。远志皂苷[10]和丹酚酸B[11]都能显著提高海马神经元抗氧化酶活性，抑制氧化物和自由基产生，从而发挥神经保护作用。心脑舒通[12]和补骨脂酚[13]分别可以显著抑制缺氧复氧(OGD/R)和H2O2损伤所致的Neuro-2a细胞ROS增加，增加细胞活力。利用1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP )处理多巴胺能SN4741细胞，建立PD体外细胞模型，研究发现杨梅苷可以显著抑制ROS生成，发挥抗氧化作用从而使细胞活力增加[14]。松果菊苷可显著抑制6-Hydroxydopamine(6-OHDA)损伤的PC12细胞细胞活力降低，抑制ROS产生，通过调控线粒体功能从而保护神经元损伤[15]。苦参碱可以抑制OGD/R引起的大鼠脑原代海马神经元细胞内钙离子升高，减少氧化产物的产生，保护细胞形态，增加细胞活力[16]。

3.3中药调节线粒体生物合成

邓丽丽等用竹节参总皂苷作用于H2O2诱导损伤的SH-SY5Y神经细胞，发现经H2O2处理的细胞Sirt1、PGC-1alpha;和Foxo3a的表达量均下调，竹节参总皂苷预给药后能上调Sirt1、PGC-1alpha;和Foxo3a表达，表明其改善H2O2引起的氧化损伤机制可能与调节线粒体生物合成有关[17]。杨军岭等研究发现，用MPP 处理PC12细胞后，线粒体PGC-1，NRF-1和TFAM表达明显降低，而丹酚酸B可显著逆转这些变化，表明丹酚酸B对PC12细胞线粒体功能的保护作用很可能与维持线粒体生物合成相关[18]。LiuP等研究发现槲皮素可以通过调节Sirt1，PGC-1alpha;，以及与线粒体生物发生相关的蛋白质的表达改善海马线粒体和突触病变，从而显著降低缺氧诱发的记忆衰退[19]。

3.4中药维持线粒体融合/分裂平衡

最近研究发现一些中药可以调节线粒体动态平衡，维持神经细胞线粒体功能。据报道，丹酚酸B也能抑制MPP 所致的PC12细胞Opa1、Mfn1表达降低，并抑制Drp1和fis1表达增加。提示丹酚酸B可通过调控线粒体融合和分裂平衡维持线粒体功能，从而保护细胞损伤[20]。低浓度补正散合大补阴丸(QZS＆DBYW)处理可以改善MPP 刺激后的SH-SY5Y细胞线粒体形态及细胞形态，使线粒体长度和分支有所增加，呈网络分布，且胞内没有明显空泡，细胞核清晰。提示低浓度牵正散合大补阴丸中药复方可能对过度分裂起到一定抑制作用，而对线粒体融合具有促进作用，从而达到保护细胞的作用。另外，杨梅苷能显著抑制MPP 引起的多巴胺能SN4741细胞引起的线粒体分裂增加，减少线粒体碎片，调节线粒体功能，从而减轻线粒体功能障碍[21]。

3.5其他

葛根素可通过激活PC12细胞及原代大鼠中脑神经元的线粒体精氨酸酶2从而改善6-OHDA诱导的NO介导的线粒体损伤，发挥神经保护作用[22]。

也有研究表明中药通过抑制线粒体功能抑制细胞增殖发挥抗癌作用，如丹酚酸B能够显著增加射线照射后U251细胞ROS的产生，并增加线粒体的肿胀程度，促进细胞凋亡，增加对胶质瘤细胞的放疗增敏作用[23]。葫芦素B抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖，这一影响可能通过诱导细胞凋亡、ROS积累、线粒体膜去极化及其相关蛋白表达变化来实现，对研究和治疗神经母细胞瘤具有重要的理论意义[24]。

综上所述，中药可以通过调控神经细胞线粒体功能发挥神经保护作用，这为中药治疗神经退行性疾病提供了理论依据和实验参考，同时也为中枢性神经系统疾病开发新药提供潜在靶点，具有一定临床应用前景。

参考文献

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