开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
非酒精性脂肪性肝病的肝组织病理变化与酒精性脂肪肝相似，但是患者通常没有饮酒酗酒史，是一种获得性代谢疾病。关于非酒精性脂肪性肝病的发病机制比较复杂，需要解释不同因素均可导致肝脏脂肪沉积的组织学变化的同时解释肝脏脂肪沉积后病情发展为脂肪性肝炎和肝硬化的现象，由此提出了“二次打击”学说。“二次打击”学说由动物实验结果得出，将非酒精性脂肪性肝病的发病机制分为两个阶段，也就是两次打击。第一次打击指由胰岛素抵抗等各种因素导致肝脏中脂肪沉积，使得肝细胞发生组织学变化。这些因素包括胰岛素抵抗、线粒体beta;氧化抑制剂等，他们通过抑制线粒体的beta;氧化，使得细胞内游离脂肪酸增加，同时促进肝细胞对游离脂肪酸的利用，使得肝细胞合成甘油三酯贮存在肝细胞中，最终导致肝脏中脂肪沉积。第二次打击指各种因素使得细胞内自由基增多，并导致脂质过氧化，或是产生某些可直接损伤肝细胞的细胞因子导致炎症坏死。导致自由基增多的因素包括：①甲醛、亚硝胺、游离脂肪酸含量增加和甲硫氨酸胆碱的减少诱导细胞色素P450CYP2E1的含量增加，细胞色素P450CYP2E1可以促进细胞内自由基显著增加。②体内游离脂肪酸含量增加促进过氧化物酶体beta;氧化产生氢过氧化物，氢过氧化物在体内游离的铁离子的作用下可以产生大量的高活性的自由基。③呼吸链抑制剂类型的药物也可以促进自由基的产生。自由基将脂质过氧化后的产物可以形成Malloy小体，也可以促进胶原纤维的合成，在肝脏形成纤维化甚至肝硬化。
但是目前“二次打击”学说日益受到挑战，原因在于非酒精性脂肪性肝炎的发病的分子途径有很多，而且非酒精性脂肪性肝炎是否总是发生在非酒精性脂肪肝之后也不确定。此外有研究发现通过抑制小鼠肝脏的甘油三酯的合成的确可以减轻肝脏的脂肪变性的现象，但是却加重了小鼠肝脏的损伤和纤维化，小鼠肝脏的甘油三酯的沉积不足以诱导肝脏炎症。这一研究结果表明，甘油三酯在肝细胞中的沉积并不是使非酒精性脂肪性肝病病情发展的主要因素。这与“二次打击”学说所认为的肝细胞中堆积的甘油三酯会导致炎症、纤维化、氧化应激、脂质过氧化截然不同。
另一种解释非酒精性脂肪性肝病的发病机制的学说为脂毒性学说。脂毒性学说认为使得肝细胞损伤的主要脂质并非堆积的甘油三脂，而是游离的胆固醇、游离的脂肪酸以及其代谢产物。这些物质会引起内质网应激、氧化应激以及炎症反应。过多的脂肪酸沉积在细胞中会对细胞线粒体膜的流动性带来破坏，导致氧化应激。胆固醇结晶早细胞中堆积则会激活炎症小体，促进炎症因子的生成。
非酒精性脂肪性肝病的致病因素和临床的表现都有高度的特异性，并非所有患者的致病因素都相同，但是这些高度特异性的致病因素的一个共同点是肝脏处理碳水化合物和脂肪酸这类主要能源物质的能力不堪重负。代谢物诱导肝细胞发生应激、损伤甚至死亡，导致纤维化和基因组不稳定的现象出现，从而诱发肝硬化和肝细胞癌。因此，脂肪酸的过量或是对于脂肪酸的代谢处置受损时，相对过量的脂肪酸可能成为产生脂毒性的物质，从而引发肝细胞的损伤。
为了避免肝细胞中合成过量脂肪酸，可以阻断或抑制肝细胞上的质膜柠檬酸转运体/钠离子依赖的柠檬酸转运体。柠檬酸盐是细胞三羧酸循环的中间产物，除了在能量代谢中的重要作用外，还作为脂肪酸合成的前体和调节器。故脂肪酸合成速率与柠檬酸盐的胞浆浓度直接相关。细胞质中有三种主要的柠檬酸来源，包括通过SLC25A1基因编码的线粒体柠檬酸载体(CIC)从三羧酸(TCA)循环中流出到细胞质，通过SLC13A5基因编码的钠离子依赖的柠檬酸转运体(NaCT)从血液循环流入细胞质以及通过谷氨酰胺分解后产生的alpha;-酮戊二酸被羧化所产生的柠檬酸。SLC25A1与SLC13A5都属于SLC13A家族，这个家族中包含5个基因，都负责编码跨膜转运蛋白。家族成员按照功能可以被分为两类：转运硫酸盐、硒以及硫代硫酸钠的共转运蛋白，包括SLC13A1和SLC13A4；转运三羧酸循环中间体琥珀酸、柠檬酸以及alpha;-酮戊二酸的共转运蛋白，包括SLC13A2、SLC13A3、SLC13A5。SLC13A家族成员在不同的器官细胞中表达水平不同，发挥着不同的生理作用。其中SLC13A5主要表达在肝脏中，虽然在睾丸、大脑、肾上腺也有表达，但是在这些器官中的表达水平与肝细胞中的表达水平相比低许多。肝细胞主要通过由SLC13A5基因编码的钠离子依赖的柠檬酸转运体(NaCT)由细胞外输入柠檬酸，为细胞中的脂质合成提供反应前体。因此，该转运体作为肝细胞控制柠檬酸转运的控制开关，是抗非酒精性脂肪性肝病药物的潜在靶点。本课题所研究的化合物249554（以下简称化合物554）是本课题组前期在体外药理活性方面筛选出优势候选化合物，是一种柠檬酸类似物，可以通过底物竞争与立体变构的方式与SLC13A5特异性结合，抑制SLC13A5，接下来将会对该化合物的药代动力学性质展开初步研究。
为了研究化合物554在大鼠体内的药代动力学，本课题将建立一种用于分析化合物554的大鼠血浆样本的液质联用(LC-MS/MS)分析方法。LC-MS/MS技术是一种现代的、简便的、快捷的体内药物及代谢产物的分析技术。LC-MS/MS技术将液相色谱的高分离度的优点与质谱灵敏度高、选择性好的优点相结合，同时还可以提供丰富的化合物的结构信息。利用LC-MS/MS技术可以方便地建立起分离度高、检测限低、分析速度快、分析结果准确的分析方法。在药物代谢动力学研究中使用LS-MS/MS技术不仅可以减少分析方法开发建立的时间，减少样品处理和分析的时间，而且在检测鉴定代谢产物时有更高的灵敏度，可以用来分离鉴定体内的痕量代谢产物。此外，LS-MS/MS技术还有可以同时分析一份样品中的母体药物与代谢产物、单一药物通过鸡尾酒疗法给药后同一生物样品中的多种化合物、不同化合物混合的样品的能力，使药物与代谢产物可以分离与鉴定同时进行。LC-MS/MS技术的普及使得药物代谢动力学工作者的研究可以更加高效、准确，也可以实现一些旧方法难以实现的实验想法。
本课题对大鼠分别进行静脉注射5 mg/kg及灌胃给予50 mg/kg化合物554，在给药后的不同时间点进行采血处理得到血浆样品进行保存。之后用LC-MS/MS进行分析，测定血浆样品中的化合物554浓度。利用药代动力学专业软件WinNonlin 7.0，以统计矩方法计算药动学参数。并用GraphPad Prism 8.0绘图软件绘制药时曲线图。
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