FXR抗肝细胞凋亡的作用模式确证文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

文献综述：FXR(法尼酯衍生物X受体)是核受体超家族的一员，它是一种配体激活的转录因子。胆汁酸是它主要的内源性激动剂。FXR主要分布于肝肠系统，对于调节体内的胆汁酸平衡，胆固醇，甘油三脂和糖代谢，维持肠道菌群稳定有重要作用。因此，对FXR进行研究对于糖尿病、胆囊结石已经肝肠毒性等代谢性疾病的治疗存在可观的治疗前景。

法尼酯衍生物受体的命名源于其可以被生理水平的法尼酯激活。FXR属于激素核受体超家族的一员。具有典型的核受体结构,即包括氨基末端高度保守的DNA结合区(DBD)、羧基末端配体结合区(LBD)、氨基末端的配体非依赖性转录激活功能区(AF-1)和羧基端有一个配体依赖性激活功能区(AF-2)等。与其他核受体家族成员一样,FXR的DBD区内有与DNA结合和二聚化有关的锌指结构。当配体与LBD直接结合后,核受体空间构象发生变化,并与靶基因的启动子结合从而调节靶基因的转录。FXR需要和视黄醛衍生物受体(RXR)形成异源二聚体后才能直接和特定DNA反应元件结合。FXR最初是用基于高度保守的激素核受体DNA结合区设计的寡核苷酸,利用酵母双杂交实验和人的RXR配体结合区作钓饵钓出来的孤儿激素核受体。法尼酯-保幼激素Ⅲ、全反视黄酸和人工合成的视黄醛衍生物TTNPB在高浓度下可以激活FXR。

FXR基因由含有11个外显子和10个内含子的76997个碱基组成。已经证明小鼠FXR有四种亚型,即FXRalpha;1、FXRalpha;2、FXRbeta;1和FXRbeta;2。四种亚型的FXR转录都源于同一基因。例如,FXRalpha;转录开始于外显子1,FXRbeta;转录开始于外显子3,但FXRalpha;和FXRbeta;共享外显子4～ 11,所以FXRbeta;的转录产物比FXRalpha;少187个碱基,但编码的蛋白在氨基末端比FXRalpha;多37个氨基酸。另外位于外显子5和6间的重复叠连区的变化进一步产生了FXR的亚型,FXRalpha;1和FXRbeta;1在与DNA结合区相临的铰链区有一个4个氨基酸(12个bp)的插入序列,而FXRalpha;2和FXRbeta;没有类似的结构。上述4个氨基酸的插入序列在调节FXR功能上有重要的作用,可以影响FXR与DNA的结合,FXR在RXR反应元件上与RXR二聚化的能力,FXR与协同激活因子或辅助抑制因子间的相互作用。

肝病系指肝脏的正常生理和生化功能在各种病因的作用下发生障碍而出现的一系列临床症状与体征，主要包括病毒性肝炎、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝癌等。近年来，肝病的发病率和致死率不断上升，严重影响着人类健康与社会经济发展。深入研究慢性肝病的发病机制，寻求有效的防治措施对于人类的健康具有广泛而深远的意义。

肝脏是机体最重要的物质转化器官。肝损伤时，解毒功能减弱，机体代谢发生紊乱，促使疾病进一步恶化。新近研究发现，FXR在物质代谢以及肠道菌群稳态中发挥重要作用，通过多种途径调控肝病及其并发症的转归。

对小鼠进行肝脏部分切除手术，结果发现FXR能促进肝脏再生。肝损伤后通过再生恢复肝重及功能，正常的肝脏修复完成后其修复活动会准确停止，而长期慢性肝损伤会导致肝细胞重复坏死及再生，使肝细胞再生过程失控最终导致癌变发生。，HCC（肝细胞癌）患者肝脏中 FXR表达异常降低。除肝细胞癌变，FXR敲除小鼠肝脏中还观察到明显的肝细胞凋亡和坏死，细胞周期相关蛋白 Cyclin D1、Cyclin E1 表达增加，表明 FXR对肝细胞命运具有重要作用。

拟解决的科学问题：有关FXR调控肝细胞凋亡的认识还有较大争议。课题组前期研究结果显示FXR过表达后可以显著对抗肝细胞凋亡，在本项目的研究中我们拟考察FXR抗肝细胞凋亡的作用模式。

采用的研究手段：分别通过对比Ad-FXR转染与Ad-VP16-FXR转染、Ad-FXR转染并联用FXR拮抗剂以及Ad-VP-16-FXR转染联用FXR拮抗剂，考察上述不同刺激条件下对ActD/TNFalpha;诱导的肝细胞活力的降低、凋亡率的升高以及FXR蛋白表达量和FXR下游靶基因表达的不同调控作用，确证FXR的作用模式。

实验仪器及材料：

1、材料

腺病毒（Ad-Ctrl， Ad-FXR， Ad-VP16-FXR）由美国NIH 的Frank J Gonzalez教授惠赠，并由百灵威生物科技有限公司（深圳，中国）扩增，FXR拮抗剂Guggulsterone(GS)，放线菌素D（Actinomycin D，ActD）等均购自Sigma-Aldrich公司（St Louis，MO，USA）；重组人肿瘤坏死因子alpha;（Tumor Necrosis Factor alpha，TNFalpha;）购自Peprotech公司（Rocky Hill，USA）。

人肝癌细胞系HepG2细胞购于美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC，Rockville，MD，USA），DMEM培养基购自GIBCO公司（Gland Island，New York，USA），胎牛血清（Fetal Bovine Serum）购自Hyclone公司（Logan，Utah，USA）。胰蛋白酶（Trypsin）购自Amersco（Solon，Ohio，USA），青霉素和链霉素购自南京生兴生物工程公司（江苏，中国）。细胞培养耗材（培养瓶、细胞板等）购自Costar（Cambridge，MA，USA）。

MTT生兴生物；AV-PI购自BD

RNAiso Plus，PrimeScript RT Reagent Kit和SYBR Green Reagent Kit均购自TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd（大连，中国）。所有引物均由Invitrogen（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）设计合成。DEPC水、RIPA强裂解液、苯甲基磺酰氟(Phenylmethysulfonyl fluoride，PMSF)、BCA 蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所（江苏，中国）。Glycine（电泳纯）、SDS（电泳纯）、Tris-base（电泳纯）和过硫酸铵（Ammonium persulfate，APS）购自Amresco（Solon，OH，USA）。30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)、N,N,Nrsquo;,Nrsquo;-四甲基乙二胺（N,N,Nrsquo;,Nrsquo;-tetramethyl ethylene diamine，TEMED）均购自Bio-Rad（Hercules，CA，USA）；增强型化学发光试剂盒（Enhanced Chemiluminescence，ECL）购自 Pierce Chemical （Stoughton，WI，USA）。光明牌脱脂奶粉（上海，中国）。PVDF膜购自Millipore公司（Billerica，MA，USA）。FXR抗体购自Santa Cruz公司Santa Cruz Biotechnology（Dallas，Texas，USA），GAPDH抗体及羊抗兔IgG二抗购自Bioworld公司（St Louis Park，MN，USA）。

磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、氯化镁、氯仿、异丙醇、无水乙醇、分析纯N,N-二甲基甲酰胺（DMSO）、甲醛等试剂均为市售分析纯。实验用水为Milli-Q超纯水机制备（Millipore Corporation，Billerica，MA，USA）。

2、仪器与设备

实验方案：

1. 细胞凋亡

Ad-Ctrl,Ad-FXR,Ad-VP16-FXR分别转染HepG2细胞。

实验分组

细胞点于96孔板，Ad-Ctrl、Ad-FXR、Ad-VP16-FXR给予ActD/TNFalpha;；Ad-Ctrl-GS、Ad-FXR-GS、Ad-VP16-FXR-GS给予ActD/TNFalpha; GS。

1. 流式细胞仪检测细胞凋亡

流式细胞仪AV-PI检测凋亡。

1. 提取蛋白，Western Blot验证转染效率
2. 提取总RNA，PCR验证转染效率，检测下游基因SHP、BSEP、CYP7A1表达量。