千层纸素苷对四氯化碳诱导肝纤维化抑制作用的研究文献综述

 2022-12-17 07:12


课题应达到的目的

研究并证实黄酮类化合物千层纸素苷对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化具有抑制作用

研究内容和研究手段

通过腹腔注射四氯化碳溶液建立小鼠肝纤维化模型，采用灌胃方式给予小鼠千层纸素苷，实验5周，处死小鼠，采用动物组织匀浆、免疫组化、HE染色、实时荧光定量PCR和Western Blot等方法证实千层纸素苷是否具有抑制小鼠肝纤维化能力。

    1. 实验动物和材料 野生型小鼠（C57BL/6J）。四氯化碳溶液、橄榄油（作为溶剂）、匀浆器、荧光定量PCR系统、免疫组化试剂盒、HE染色试剂盒。
    2. 通过四氯化碳诱导建立肝纤维化活性 将雄性8~10周龄（25~30g）的野生型小鼠45只随机分为3组，即正常对照组15只、模型对照组15只、千层纸素苷剂量组15只。模型对照组小鼠以10%Cl4橄榄油溶液2ml/kg体重的剂量腹腔注射，每周注射3次（隔天1次），连续注射5周。正常对照组、千层纸素苷干预组小鼠给予等量清水腹腔注射。千层纸素苷干预组小鼠于造模之日起给予千层纸素苷120mg/kg灌胃，正常对照组和模型对照组小鼠给予等量生理盐水灌胃。在造模第4周末，分别处死正常对照组，模型对照组、千层纸素苷干预组每组3只小鼠，观察造模和药物干预情况。造模开始后第5周末，全部小鼠颈椎脱臼处死，留取血清，迅速取肝组织于-80℃保存。
    3. 肝组织病理学检查 肝组织以4%甲醛固定，常规石蜡切片后进行HE染色，于光镜下观察肝脏病例变化。肝纤维化程度参照Scheuer标准。
    4. 肝组织匀浆 剪下一小块肝组织，将其放入玻璃匀浆管口剪碎，加入9倍体积（mL）的PBS进行匀浆。左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中保持低温状态，右手将捣杵垂直插入套管中，上下转动研磨十次（6-8分钟），充分研碎，使组织匀浆化，看不到纤维状物质为止。组织匀浆后， 2000 rpm离心，弃掉上清，收集细胞。
    5. Western Blotting检测检测LC3、ATG-5表达 抽提肝组织总蛋白，并测定浓度。SDS-PAGE凝胶经转移缓冲液（25mmol/L Tris碱、192mmol/L甘氨酸、20%甲醇）浸泡10-20min。按照多孔垫料、厚滤纸、NC膜、凝胶、厚滤纸、多孔垫料的顺序组装盒式转移塔，并将其以NC膜向阳极的方向装入转移装置。于4℃持续搅拌条件下，恒流电转移1～2h。用丽春红染液对滤膜进行染色，标记笔标记蛋白分子量标准各条带所在位置，再用去离子水洗去丽春红。滤膜经5%奶粉于室温封闭1h；与稀释于5%奶粉的一抗于4℃孵育过夜，PBST摇洗4次times;15min。用 PBST稀释二抗至工作液浓度，37℃恒温摇床避光反应1h。反应结束后弃二抗，用 PBST避光清洗3次，10 min/次，PBS清洗 1次，10 min/次。取条带曝光。
    6. 免疫组化 取石蜡切片，58~60℃脱蜡半小时，置于室温冷却。浸泡二甲苯中5分钟，重复3次；100%乙醇中3分钟，重复2次；95%乙醇中3分钟，重复2次；75%乙醇中3分钟，重复1次；蒸馏水中3分钟，1次。于蒸馏水中取出片子，转移至PBS中2分钟；转移至抗原修复缓冲液（PH 6.0）/柠檬酸盐，盖紧盖子，置于微波炉中设置800w/3分钟，检查（添加缓冲液），200w/5分钟，检查，800w/10s，200w/5分钟。打开盖子，置于室温冷却（10分钟左右）。浸泡蒸馏水中3分钟，1次；PBS静置3分钟，1次；换0.3% TritonX-100 PBS，摇床上静置20分钟；置于PBS中漂洗5分钟，重复2次；换1%H2O2（用PBS配稀释液），摇床上30分钟；置于PBS中漂洗5分钟，重复2次；取出片子，甩干，用油脂笔在肿瘤组织外围划圈。滴加约0.35-0.5mL封闭液（PBS及0.5BSA）于30分钟；滴加约0.35-0.5mL一抗（1：200封闭液），于4℃过夜。次日，换PBS漂洗5分钟，重复3次；滴加约0.35-0.5mL封闭液（含生物标记二抗）1：200，于30分钟；PBS漂洗5分钟，重复3次；换ABC溶液，室温下30分钟；PBS漂洗5分钟，重复3次；滴加配制好的DAB显色液，镜下检测染色；满意后，迅速置于蒸馏水中；苏木素染色2分钟，自然水漂洗2分钟；分别置于70%，95%及100%乙醇中（每次10s）。置于二甲苯中5分钟，重复3次；中性树胶封片，风干过夜，镜下观察。
    7. 肝组织alpha;-平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin-alpha，alpha;-SMA）基因表达检测 用实时荧光定量PCR法。在实时荧光定量PCR仪上进行实时定量扩增，以beta;-actin为内参。提取RNA：加入RNA提取液RNA iso，每个离心管1ml，吹打几次后静置样品；每个离心管中加入200mu;l的三氯甲烷使劲震摇，静置5min后超速离心机12000rpm离心15 min；小心地将上清液吸入新的离心管中，加入0.5 ml的异丙醇溶液，轻轻颠倒后放置10min；离心后倒掉上清，在沉淀中加入1 ml的乙醇溶液，清洗后再次离心；将沉淀晾干后，根据沉淀的压积加入适量的DEPC水后定量RNA的浓度；Realtime-PCR 扩增：按配方配制PCR 反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM II10mu;l，PCRForward Primer 0.8mu;l，PCR Reverse Primer 0.8mu;l，ROX Reference Dye II 0.4mu;l，cDNA 溶液2 mu;l，dH2O（灭菌蒸馏水）6 mu;l。每个浓度测量3个复孔；上ABI 7500 型荧光定量PCR 仪，设定PCR 反应程序：Stage 1：预变性Reps：1，95℃ 30 s；Stage 2：PCR 反应Reps：50，95℃5s；60℃34s。收集荧光Realtime-PCR数据，分析结果。

主要成果形式

采用统计分析软件，绘制实验结果图，并进行分析，包括小鼠体重、alpha;-SMA基因的mRNA表达水平；同时给出肝脏HE病理切片图。

主要参考文献

[1] 陈姝延, 孙亚朦, 尤红. 肝纤维化诊断的新进展[J]. 中华肝脏病杂志, 2017, 25(8).

[2] 夏璐, 杨长青. 肝纤维化治疗的研究进展[J]. 中华肝脏病杂志, 2017, 25(8).

[3] 肖敏, 屈小虎, 吕聚坪,等. 吡非尼酮对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的影响[J]. 中国应用生理学杂志, 2016, 32(4):378-382.

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