开题报告内容:
1. 研究背景
DNaseⅠ是发现最早的一种特异性DNA水解酶,在Ca2 和Mg2 等二价金属离子存在的中性pH值条件下水解双链DNA生成5磷酸末端和3羟基末端的寡核苷酸。DNaseⅠ在发现伊始仅被单纯的视为一种消化酶,参与食物来源DNA的降解。随着研究的深入,发现DNaseⅠ与细胞凋亡、细胞坏死染色质降解及系统性红斑狼疮、胃肠道肿瘤和心肌梗死发生密切相关。随着近代生命科学技术和免疫学技术的快速发展,人们发现,作为先天免疫系统的重要组成部分之一,中性粒细胞重要通过细胞吞噬,脱颗粒作用参与免疫应答;近年来发现,形成中性粒细胞外诱捕网(NETs)是一种新的免疫应答方式。NETs是由中性粒细胞释放到胞外的含有DNA、组蛋白、髓过氧化酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G的网状结构。NETs中包含多种抗原,如参与NETs内蛋白质修饰的弹性蛋白酶和组织蛋白酶, 这些抗原在胞外诱捕网产生期间,释放到细胞外基质中,被呈递给免疫活性细胞从而促进自身抗体的合成,一方面可以摧毁入侵的病原体,当NETs过量时也会对自身免疫造成影响。而诱捕网的主要结构成分是DNA,所以破坏诱捕网的DNA骨架就能够降解诱捕网,所以DNaseⅠ在理论上可以降低高水平诱捕网引起的自身免疫损伤。
2. 研究目的
第一阶段pET28a-His-DNaseⅠ质粒的构建和转化
主要是人的DNaseⅠ克隆以及基因工程菌的培养(本实验利用聚合酶链式反应克隆人DNaseⅠ基因,并在大肠杆菌中进行表达)。
第二阶段pET28a-His-DNaseⅠ蛋白的表达和纯化
3. 实验流程
1)载体的构建和转化
质粒载体的抽提
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