一、课题解决的问题
近年来，各种自然疫源性疾病呈高发态势，立克次体病是由立克次体引起的一类重要的人兽共患自然疫源性疾病。立克次氏体通常被称为蜱热，这种细菌可引起多种疾病，并通过吸血节肢寄生动物如跳蚤、虱子和蜱等传播。该类疾病目前为止尚无有效疫苗可供使用，且由于立克次体感染的临床症状不典型，普通医生对该病发病早期症状不熟悉，而专业的立克次体检测所需仪器价格昂贵，操作复杂，且需专业人员进行，难以在基层单位普及，因此立克次体感染极易被误诊，并因延误治疗而致死。Cb广泛分布于自然界，是Q热的病原体，是目前已知的立克次体族中唯一含有质粒的病原菌，可以不借助于媒介节肢动物通过气溶胶广泛传播，对外界物理化学因素抵抗力强，可引起人类急、慢性Q热，或伴有肺炎、心内膜炎、脊髓炎、肝炎等，目前已成为分布最广的人兽共患病之一。因Q热无特异性临床表现，常被误诊为流行性感冒、沙门氏菌感染、肺炎、传染性肝炎、布鲁氏菌感染等。针对上述现状，本文以贝氏柯克斯体为研究对象，旨在开发一套基于重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）快速检测贝氏柯克斯体的诊断方法，拟采用RPA技术研制贝氏柯克斯体的快速、简易、准确、特异的分子诊断试剂，目的是在低温条件下实现快速特异性扩增（3742℃，620min），结合核酸胶体金检测试剂条实现快速可视化诊断，将解决贝氏柯克斯体的检测不能在基层推广的难题，尤其适用于野外环境下对突发状况快速准确诊断。
二、研究方法和技术路线
2.1生物信息学软件
MAUVE软件，国家生物技术信息中心NCBI(National Center for Biotechnology Information)，Prime 5软件。
2.2实验方法
通过MAUVE软件和BLAST在线程序分析贝氏柯克斯体的全基因组序列，选取特异性的保守序列；针对每条保守序列，使用Prime 5软件根据RPA引物探针设计原则设计至少5组上下游引物及探针。引物在30bp以上，每条下游引物5端标记生物素（Biotin）；探针在45bp-60bp，5端标记荧光素FAM，3端添加延伸阻断基团（blocker，如磷酸基团），在第30-40位碱基之间使用碱基类似物（通常为四氢呋喃（THF））替代其中一个核苷酸，序列结构参考5 -FAM-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-[THF]-NNNNNNNNNNNNNNN-blocker- 3。本方法中设计下游引物5端标记生物素，成功扩增后获得的双链DNA将标记有生物素；探针与扩增后的DNA退火，RPA系统中的nfo酶将在THF部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3端继续延伸，最终获得FAM和Biotin双标记的扩增产物。
三、论文课题研究进度安排
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