赫赛汀抗体表达条件的优化开题报告
本课题的主要内容是通过将赫赛汀的基因做成免疫脂质体的形式转染到真核系统中进行表达，并且对表达条件进行一系列的优化，从而制备出高效的赫赛汀抗体。
研究表明，乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，全世界每年新增的乳腺癌患者约有120，占女性所有肿瘤的18%。其中，25%～30%的乳腺癌患者的癌细胞Her-2/neu高表达。赫赛汀是一种针对Her- 2/ neu蛋白设计的人源化单抗，通过基因工程的方法将非特异性的人IgG的恒定区与鼠的抗Her-2/neu IgG的Fv区嵌合在一起，不仅对Her-2受体有高度的亲和力，减少体内人抗鼠抗体的产生，降低了免疫原性，从而可以成功地广泛应用于临床。本研究对赫赛汀抗体进行人源化的哺乳动物细胞表达。选用了实验室以及工业生产重组蛋白的首选宿主细胞HEK293细胞系进行瞬时表达赫赛汀抗体。通过对HEK293F细胞瞬时表达条件进行优化，考察 HEK293F 细胞中最优的瞬时表达转染条件，建立了一套高效的瞬时表达系统，为推动了本实验室人源性抗体研发平台的建立，光敏剂药物以及ADC药物的研究打下了坚实的基础。近年来，人们根据 HER2 结构构建了具有靶向作用的单克隆抗体曲妥珠单抗(TMAB)。曲妥珠单抗是一种重组的人源化单克隆抗体，能与 HER2 受体结合，具有较强的亲合力和特异性，通过阻断人体表皮生长因子
在 HER2 上的附着，发挥抗肿瘤效应，为乳腺癌的治疗提供了
新途径。曲妥珠单抗(即赫赛汀)已于 1998 年 10 月由美国 FDA
正式批准上市。
免疫脂质体(immunoliposome，IML)是将抗体或配体通过聚合物(如聚乙二醇衍生物)连接在脂质体的表面，借助抗体或配体的特异性靶向作用，能够与肿瘤细胞表面上的抗原或者受体结合的作用，实现载药免疫脂质体的主动靶向作用，在靶区释放包封的药物，特异性杀伤靶细胞，达到治疗的目的。免疫脂质体具有制备工艺简便、 无毒、 免疫原性反应弱及可被生物体降解等优点，是现阶段抗体靶向治疗的研究热点。
赫赛汀又叫曲妥珠单抗。曲妥珠单抗是一种重组DNA 衍生的人源化单克隆抗体，特异性地作用于人表皮生长因子受体-2(HER2)的细胞外部位。此抗体含人IgG1 框架，互补决定区源自鼠抗p185 HER2 抗体，能够与HER2 绑定。
HER2 原癌基因或C-erbB2 编码一个单一的受体样跨膜蛋白，分子量185kDa，其结构上与表皮生长因子受体相关。在原发性乳腺癌患者中观察到有25%-30%的患者HER2 过度表达。HER2 基因扩增的结果是这些肿瘤细胞表面HER2 蛋白表达增加，导致HER2 受体活化。
曲妥珠单抗在体外及动物实验中均显示可抑制HER2 过度表达的肿瘤细胞的增殖。另外，曲妥珠单抗是抗体依赖的细胞介导的细胞毒反应（ADCC）的潜在介质。在体外研究中，曲妥珠单抗介导的ADCC 被证明在HER2 过度表达的癌细胞中比HER2 非过度表达的癌细胞中更优先产生。
致癌作用、突变、对生育的损害未检测曲妥珠单抗的致癌潜能。
在标准 Ames 细菌和人外周血淋巴细胞致突变试验中，曲妥珠单抗浓度达到5000mu;g/mL时，未观察到致突变反应。在体内微核试验中，快速静脉注射达到 118mg/kg 的曲妥珠单抗后，未有观察到小鼠骨髓细胞染色体损害的证据。
生育研究在雌性猕猴体内完成，曲妥珠单抗每周给药剂量高达人类维持剂量 2mg/kg 的25 倍，未发现生育受损。曲妥珠单抗对男性生育能力的影响未进行研究。
赫赛汀抗体作为第一个上市的全人源化抗体，其应用广泛。所以，我本次课题的主要内容就是对赫赛汀抗体表达条件进行优化，从而得到更高浓度、更高活性的抗体。本次课题的主要内容有：
- 采用无缝克隆技术对赫赛汀的重链和轻链进行克隆，得到大量重链和轻链的基因。
- 采用真核系统（HEK-293F细胞）对其进行表达，得到赫赛汀抗体。
- 预实验是将绿色荧光蛋白转染到293F细胞中，并用荧光显微镜进行蛋白的验证。
- 对赫赛汀抗体表达条件进行优化。例如质粒与PEI的比例、转染时间等。
本次课题的创新点在于采用真核表达系统，采用瞬时转染系统，能够很快的得到相关蛋白;293F细胞采用悬浮培养，而且抗体选用全人源化抗体曲妥珠单抗。
通过本次课题，主要让学生学习各种生物有关的技术，掌握真核转染系统以及抗体表达方法，能够独立完成相关实验，并且能够进行独立设计实验，真正成为生物制药领域的高级人才。
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