胆总管结扎诱导肝纤维化模型的建立及抗肝纤维化药物筛选研究文献综述

 2022-12-24 03:12

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

  1. 课题解决的问题
  2. 查阅相关文献，掌握胆总管结扎诱导肝纤维化模型的建立及评价。
  3. 设计造模实验并实践操作，建立胆总管结扎诱导肝纤维化模型并评价造模情况。
  4. 查阅相关文献，了解FLIPR筛选药物的方法。
  5. 以构建的模型为实验平台，运用FLIPR筛选抗肝纤维化的有效药物。
  6. 研究方法和技术路线
  7. 造模实验

实验采用C57小鼠，大致操作如下：用注射或吸入麻醉的方法麻醉小鼠；在腹部的中线处剖开腹腔，在十二指肠肠系膜中找到白色的胆总管并将胆总管与其他组织分离；然后在胆汁流出的上游结扎两次，下游结扎一次，在最后一个结扎部位上方切开胆总管；使用倒置的间断缝合线将腹部闭合，可注射抗生素防止感染。设置假手术的对照组，麻醉后打开腹腔分离胆总管但未结扎或横切，其余条件应相同。于手术结束后第5，10，14天分批处死动物，同时处死假手术组作为对照。

  1. 造模评价
  2. 观察一般情况、体质量及肝脾指数观察：大鼠生活状态、食欲行为、毛发、动物死亡情况、体重情况和肝指数（肝湿重/体质量times;100%）。
  3. 血清肝功及肝纤维指标：丙氨酸转氨酶（ALT）、门冬氨酸（AST）、总胆固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）、Ⅲ型前胶原N端肽（PCⅢ）、Ⅳ型胶原（CIV）、层粘连蛋白（LN）与透明质酸（HA），使用Western blot、q-PCR等方法测定。
  4. 肝组织病理学检测：将取下的肝组织标本用10%甲醛固定后，常规脱水，包埋，制作成5mu;m厚切片，HE染色，光镜下观察。
  5. 以构建的模型为实验平台，筛选抗肝纤维化的有效药物。
  6. 论文课题研究进度安排

2020年3月1日——3月中下旬：确定选题，查阅文献，撰写开题报告，完成综述部分。

2020年3月中下旬——5月31日：设计实验，完成实验，并完成论文初稿。

2020年6月15日前：修改论文，正式提交论文，并准备毕业论文答辩。

  1. 文献综述

1.肝纤维化及其发病机制

肝纤维化是各种致病因素引起的肝脏结缔组织异常增生，引起肝小叶改变、假小叶与结节形成，最终可能会导致肝硬化。虽然与其他器官纤维化一致，肝纤维化的实质也是细胞外基质异常增生积累，但肝脏生长旺盛的特征使肝纤维化在早期不易表现出来，到察觉之时往往已经导致肝硬化了。我国是慢性肝病大国，各种肝脏疾病每年都呈现上升的趋势，因此研究肝纤维化的发病机制显得尤为重要。[1]

肝脏是人体内最大的解毒器官，大部分营养元素、代谢产物、内源活性物质和药物都会经过肝脏的代谢，肝细胞难免会接触一些细胞毒性物质导致细胞损伤，从而产生一些损伤相关模式因子，导致炎症反应，同时活化炎症相关的信号通路，促进炎症反应的发展。肌成纤维细胞在促进肝纤维化中扮演着重要的角色，由于肝细胞损伤导致各种因素催化肝星状细胞、成纤维细胞、循环纤维细胞和损伤的胆管细胞等分化为肌成纤维细胞。例如，本篇文章讲到的总胆管结扎诱导肝纤维化就是使胆管阻塞导致胆管上皮的成纤维细胞和肝星状细胞等分化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞可以导致肝星状细胞大量积累形成瘢痕组织；激活TGF-beta;信号通路，使肝纤维化加剧；诱导血管梗阻性病变和肝癌的发生。[2]

肝星状细胞是肝纤维化过程中发挥最主要作用的细胞类型，静止状态下的肝星状细胞是维生素A的储存场所，肝细胞损伤会激活肝星状细胞。肝星状细胞的活化可能与以下过程有关：PDGF、VEGF、CTGF和TGF-beta;等细胞因子的刺激；由Fas和TRAIL介导的肝细胞凋亡导致肝细胞衍生的凋亡小体激活肝星状细胞；损伤导致肝血窦内皮细胞分化的改变进而导致肝星状细胞的激活；枯否细胞和浸润性单核细胞表达许多趋化因子受体可能激活肝星状细胞；淋巴细胞包括肝巨噬细胞、T细胞和B细胞可能通过细胞因子的产生激活肝星状细胞；通过脂质过氧化作用产生的ROS可以激活肝星状细胞；一些转录因子和靶基因也介导肝星状细胞的激活。而通过增强NK细胞作用直接杀伤活化的肝星状细胞，增加激活肝星状细胞相关的基因的miRNA、lncRNA和促进相关DNA的甲基化也可抑制其激活。[3][6]活化的肝星状细胞在生长因子的作用下转化为肌成纤维细胞，大量合成细胞外基质主要是纤维化胶原蛋白，特别是胶原蛋白Ⅰ；抑制基质金属蛋白酶从而减少细胞外基质的降解；同时在一些内源活性物质的作用下收缩，阻塞血流从而引发门静脉高压的并发症。

参与肝纤维化的细胞因子有许多：PDGF、VEGF、CTGF、TIMP、表皮细胞生长因子、MCP-1、CXCR3、NO、NOX、血管紧张素Ⅱ、局部黏附斑激酶、TGF-alpha;、TGF-beta;、瘦素等脂肪细胞因子、白细胞介素等炎症介质可促进肝纤维化的进展；胸腺素beta;4、核因子E2相关因子2、硫氧还蛋白、肿瘤坏死因子-alpha;、PPAＲgamma;和脂联素等可抑制活化的肝星状细胞而抑制肝纤维化。[4][5][8]同时肝纤维化也有许多信号通路参与：TLR4信号通路等炎症相关信号通路激活炎症反应；TGF-beta;信号通路主要通过Smad依赖性通路和p38/MAPK信号通路增加细胞外基质合成和诱导肝星状细胞活化；NF-кB信号通路一方面增强TGF-beta;信号通路，一方面又有一些抗肝纤维化的作用；Hedgehog信号通路和Notch信号通路与肝星状细胞的活化密切相关；Wnt/beta;-catenin信号通路促进肝星状细胞的转化和生长；Integrinbeta;1信号通路介导细胞与细胞外基质成分之间的粘附和双向信号传导同时诱导Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成。[7][9][10]

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