1. 拟研究或解决的问题1.1 构建一种高效的人源Keap1真核表达载体并鉴定。
1.2 通过转染使Keap1在肿瘤细胞中呈现过表达的状态，并验证转染效率。
2. 研究手段2.1 Keap1真核表达载体的构建与鉴定2.1.1 人Keap1基因的扩增将对数生长期的细胞接种于细胞培养皿中，在细胞生长至 80%~90%融合时，收取细胞，按试剂盒使用说明书提取总RNA。
取5mu;L RNA样品，对样品进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，通过凝胶成像仪观察并保存结果。
使用紫外分光光度计检测RNA浓度和质量，样品的OD260/280值在1.8~2.0之间，则可以使用，如果OD260/280值大于2.0，RNA样品有可能部分降解；如果OD260/280值小于1.8，说明样品中有蛋白质等污染物。
总RNA为模板在PCR仪中反转录合成cDNA。
用SnapGene进行表达质粒的构建，确定限制性核酸内切酶酶切位点组合。
在NCBI官网上检索人源Keap1基因的mRNA序列，于Primer-BLAST设计并筛选引物，引物序列送至引物合成公司并合成引物。
取反转录生成的cDNA 2mu;L，PCR扩增人Keap1基因，Keap1基因是长片段基因，故PCR体系中加入高保真Taq酶。
扩增条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸7min；4℃保存。
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