课题名称 xCT转运体调控胰腺癌耐药的分子机制课题性质 radic; 基础研究 应用课题 设计型 调研综述 理论研究 开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）一：拟研究的问题胰腺癌是一种高侵袭性的恶性肿瘤，早期症状不明显，发病迅速，术后复发率高，并且吉西他滨耐药现象严重，本研究拟对xCT转运体的调节亚基SLC3A2在胰腺癌细胞PANC-1和MIAPaca-2中的功能进行探索，研究它对胰腺癌细胞增殖，周期和凋亡的影响，并探索SLC3A2在胰腺癌吉西他滨耐药中的机制。 二：研究手段
常规活化培养胰腺癌细胞PANC-1和MIAPaca-2。对xCT转运体进行基因测序，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术沉默SLC3A2基因，通过克隆技术构建SLC3A2的shRNA表达质粒建立稳转细胞系，通过Western Blot技术和TRIzol试剂盒抽提mRNA对基因沉默进行检测。通过CKK-8观察正常胰腺癌细胞与敲除株的增殖情况，通过FACS细胞周期检测实验检测周期和凋亡的区别，测定敲除株表型，通过MTT检测细胞吉西他滨IC50值检测对不同浓度吉西他滨的耐受性，探索SLC3A2在胰腺癌吉西他滨耐药中的机制。
三：进度安排 2021.3.1-2021.3.10 文献阅读 2021.3.11-2021.4.11 细胞培养及SLC3A2敲除株构建 2021.4.12-2021. 5.20 敲除株表型测定 2021.5.21-2021.6 总结结果完成论文 四、文献综述： 1.胰腺癌的治疗及耐药性胰腺癌是人类最具致命的恶性肿瘤之一, 胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)是其中最常见的类型, 约占90%。尽管PDAC治疗技术不断进步, 但在过去40年中生存率改善有限, 其5年生存率仍低于9%。对于临界可切除、进展期或转移性PDAC而言, 全身化疗(包括新辅助)则是最主要甚或唯一的治疗方案。其中,核苷类似物吉西他滨(gemcitabine, GEM)的单药或联合治疗仍是目前PDAC化疗的一线方案[1]。GEM作为一种前药进入PDAC细胞, 经过一系列精密调控的磷酸化过程,其衍生物可以干扰DNA合成并阻止癌细胞周期的进展[2]。但GEM治疗胰腺癌的总反应率不足20%, 约80%的患者可在1年内因肿瘤转移而死亡[3]。PDAC对GEM的耐药是影响化疗疗效并导致预后不良的最重要原因之一。肿瘤异质性是PDAC耐药性产生的主要原因,其与肿瘤微环境、遗传物质不稳定、细胞内信号分子调 控等密切相关。 2.System Xc- 胱氨酸/谷氨酸逆向转运体（cystine/glutamate antiporter system，System Xc-）是氨基酸转运蛋白家族成员之一，其首先在体外培养的人二倍体成纤维细胞中被发现，随后在肝细胞和禽类培养细胞中也陆续发现，但尚未在昆虫来源的培养细胞中观察到。该转运体的主要功能性基团为胱氨酸/谷氨酸反向运输溶质载体家族7成员11(cystine/glutamate antiporter solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)，也称为xCT。多种转录因子、转录后修饰和microRNA等参与了xCT的调控。xCT通过转运胱氨酸进入胞浆内支持硫醇分子半胱氨酸和谷胱甘肽的生物合成，从而参与氧化应激调节。研究证实:xCT在多种肿瘤细胞中高表达，与肿瘤的发生发展，尤其是与肿瘤耐药密切相关[4]。 xCT具有识别转运氨基酸差异的功能，呈现出氨基酸交换的特异性，作为谷氨酸/胱氨酸逆向转运体的功能性基团，将细胞外的胱氨酸转运入细胞内。生理条件下，摄入细胞中的胱氨酸迅速还原成半胱氨酸用于谷胱甘肽（GSH）合成，在细胞氧化还原稳态中发挥关键作用;同时，胞浆中的谷氨酸被转运到细胞间隙[5]。谷氨酸是人类12种非必需氨基酸中的一种，是谷氨酰胺的前体物质。研究[4]表明依赖谷氨酰胺维持细胞功能是肿瘤代谢的标志之一，为了维持细胞内谷氨酰胺水平，肿瘤细胞过表达xCT以满足快速增殖的需求。目前，xCT在多种类型肿瘤中表达水平升高已得到证实，xCT与肿瘤的增殖和侵袭能力有关。研究[6]证实:xCT在很多肿瘤组织和细胞中的高表达与System xc-的转录活性呈正相关关系，导致胞浆中的GSH合成增多，该生理活动与肿瘤的放化疗耐药密切相关。相应的xCT调控基因活性上调，可保护肿瘤细胞免受活性氧(reactive oxygen species，ROS)、放疗和化疗的攻击，并调控细胞对治疗的反应[4,6]；耗竭胞浆内的半胱氨酸或xCT抑制剂能够有效逆转肿瘤耐药，使肿瘤细胞恢复放化疗敏感性[7]。因此xCT是肿瘤耐药治疗的重要靶点之一。 3.SLC3A2 SLC3A2（solute carrier family 3 member 2）是氨基酸转运体（HATs）的重链组成部分，且是其运输氨基酸的必需组分。代谢重编程是胰腺癌的一个重要特征，与正常细胞相比，胰腺癌细胞对糖酵解、谷氨酰胺代谢及核苷酸合成等代谢需求显著升高［14］。肿瘤细胞的快速增殖和异常的血管生成，使肿瘤细胞处于营养物质缺乏的代谢环境。研究发现，SLC3A2在很多肿瘤细胞系、原位癌及转移癌中高表达，保证了肿瘤细胞对氨基酸的大量需求，维持肿瘤细胞的快速增殖能力，并能对肿瘤的发生过程进行调控[8]。谷氨酸代谢也在恶性胶质瘤等很多肿瘤的发生、生长及浸润转移过程中发挥着重要作用[9,10]。由此推测，SLC3A2及其相关转运体在肿瘤细胞的高表达，保证了肿瘤细胞内充足的氨基酸水平，在肿瘤的发展过程中起到了重要作用[11]。而最新的研究表明,多种肿瘤细胞表面均存在SLC3A2的高表达，并参与肿瘤细胞各种生物学行为的调节。细胞实验研究表明，沉默肾透明细胞癌细胞中SLC3A2基因的表达，能够一定程度上使其丧失细胞伸展、转移、增殖等肿瘤特性，并在动物实验得到验证[12]。使用miRNA（microRNA）介导HeLa细胞中SLC3A2的基因沉默（命名为HeLa-947细胞），再将野生型HeLa细胞和HeLa-947细胞分别注射至BALB/c裸鼠皮下，观测24天后发现，野生型HeLa细胞在注射后4~6天就可形成肿瘤，而注射HeLa-947细胞的裸鼠一般在10天以后才可见肿瘤形成，此外，HeLa-947细胞形成的肿瘤生长速度也明显减缓，肿瘤大小和重量显著降低[13]。 L型氨基酸转运体2(L-type amino acid transporter-2, LAT2)是一种中性氨基酸转运蛋白, 也是PDAC中的一种致癌蛋白, 可以激活Gln依赖的mTOR信号通路, 抑制细胞凋亡并促进糖酵解, 导致对GEM耐药，因此推断SLC3A2在胰腺癌吉西他滨耐药中存在一定作用。 五：参考文献 [1]Pusceddu S, Ghidini M, Torchio M, Corti F, Tomasello G, Niger M, Prinzi N, Nichetti F, Coinu A, Di Bartolomeo M, Cabiddu M, Passalacqua R, de Braud F, Petrelli F. 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