基于纳米粒子的光学超分辨显微成像研究进展调研文献综述

 2023-08-04 04:08
  1. 选题背景和意义：

目前已经出现了许多能够突破衍射极限的光学成像技术，其中单分子定位显微镜（SMLM）的分辨率最高（lt;50nm），是观测单分子水平生命过程的有力工具，为生命科学提供了新的研究手段,在生命科学中具有广阔的应用前景。但目前纳米载体面临着对纳米粒子表面修饰的生物识别分子进行可靠地定量分析的挑战。本文将对基于纳米粒子的光学超分辨显微成像研究进展进行调研，并探讨利用SMLM技术研究在纳米粒子表面修饰不同密度的生物识别分子的方法，从而将纳米载体技术应用到临床治疗等方面。

  1. 课题关键问题及难点：
  2. 调研并分析基于纳米粒子的光学超分辨显微成像技术的研究，寻找可靠的定量分析纳米粒子表面修饰分子密度的分子工具。
  3. 如何制备纳米粒子并对其表面进行分子修饰。
  4. 如何搭建光学超分辨显微成像平台，并对成像结果进行数据分析。
  5. 如何验证所寻找的分子工具能够定量分析纳米粒子表面的分子密度。
  1. 文献综述（或调研报告）：

纳米粒子选择性识别分子靶标的能力是纳米药物应用（如药物输送和诊断）的关键，也是纳米脂质体制剂没有进入临床应用阶段的主要原因。因此，了解纳米粒子官能团的数目和分布对于材料的合理设计至关重要。目前已经出现了多种基于纳米粒子的光学超分辨显微成像技术，利用SMLM技术研究在纳米粒子表面修饰不同密度的生物识别分子的方法。

单分子方法可以直接可视化种群分布并精确表征亚群。这些方法已被证明是研究各种生物过程的重要生物物理工具[1-3]。但是，单分子显微镜在治疗学发展中仍未得到充分利用。通过调研发现，已经出现了使用单分子荧光成像技术对附着在单层小脂质体表面的蛋白质进行定量分析的方法[4]。脂质体被用作体内药物和其他分子的递送系统已有数十年的历史[5]。用荧光标记的人造蛋白对脂质体进行表面功能化，该蛋白可靶向癌细胞表面生物标志物纤溶酶原激活物抑制剂2（PAI-2）和曲妥珠单抗（TZ，Herceptinreg;）。使用具有单分子敏感性的定制宽视野荧光显微镜对这些蛋白质偶联的脂质体进行可视化。通过计算荧光标记蛋白的光漂白步骤，研究者们计算了每个脂质体上附着的蛋白数量，对于单配体脂质体，其为11plusmn;4个蛋白。根据制备过程中加入的蛋白质的摩尔比，双配体脂质体的成像显示两个附着蛋白质的化学计量。通过两种不同方法制备的 PAI-2 / TZ 双配体脂质体表明，后插入方法产生的脂质体具有两种相等大小的蛋白质更均等的表示，表明该制备方法能够更好地控制脂质体蛋白质密度。此种单分子方法也适用于定量其他脂质体配体类型，例如抗体片段，小肽和适体等。此外，该方法允许将来进行实验以阐明配体二整流脂质体的其他特征，包括使用环境敏感型染料对脂质体的内部小叶和外部小叶进行定量标记[6]。

同时，基于可光转换荧光团的高分辨率荧光显微镜方法（如随机光学重建显微镜（STORM））也可以实现超分辨成像[7],这种方法利用不同波长的激光激发荧光团，使其在暗态和荧光态之间进行光开关的转换，进而获得超分辨图像。在每个成像周期中，仅打开一部分荧光团，从而可以以纳米精度确定它们的位置，通过对一系列成像周期获得的超分辨图像进行叠加重建进而获得超分辨图像。STORM 的显着优势是它能够通过以受控方式切换开关，从而将大量荧光团定位在衍射极限点内，因此可以将其用作一般的生物成像技术。该技术的分辨率原则上仅受每个开关周期发射的光子数量限制，而不受光波长的限制。每个开关周期检测到约 3000 个光子，与激光强度无关，预测理论定位精度为 4 nm[8]。

以上两种方法都要通过荧光标记来实现超分辨成像，而纳米尺度地形学中的DNA点累积（DNA-PAINT）技术[9]则具有更好的通用性，无需荧光标记，就可以实现功能纳米材料的可靠的定量纳米表征。 DNA-PAINT与染料的光物理性质无关，不会产生荧光闪烁，它具有可忽略的光致漂白和高复用能力，[10]因此可提供荧光显微镜所能达到的最佳空间分辨率[11]。自组装的DNA纳米结构具有亚纳米级的精度和准确性，具有前所未有的寻址能力[12]。这种可寻址性取决于将功能实体连接到这些结构中的单个DNA链上的能力。这种附着的效率取决于两个因素：目的链的掺入和该链用于下游修饰的可及性。通过DNA-PAINT技术，以分子分辨率量化DNA折纸中所有单独链的掺入和可及性。 研究发现，链结合与结构中的位置密切相关，结合率从边缘到中心逐渐增加，范围变化为48%到95%。 文献中提出的方法为合理改进DNA纳米结构的设计和组装过程提供了直接的反馈，并为基于DNA的纳米粒子提供了较为合理的定量解释[9]。

DNA-PAINT方法被证明是用于纳米材料的几何和功能表征的灵敏工具，对材料表面上可用功能位点具有高度选择性识别，可提供具有亚衍射分辨率的微创光学成像。多重DNA-PAINT成像可以区分大小相同但表面功能不同的纳米粒子。此外，使用具有强大的原位校准功能的定量PAINT（qPAINT）[13]方法，可以对单个链霉亲和素包被的纳米粒子（NP）上可用的功能位点进行计数。重要的是，这种方法与特定染料或外源标记系统的选择无关，对接链利用天然分子-配体相互作用自发地靶向活性功能位点，而无需与荧光报告分子直接偶联。qPAINT可以仅对功能性生物分子的活性位点进行选择性计数。但是，与其他定量技术一样，有效定位这些位点在qPAINT中至关重要，应谨慎考虑。即使qPAINT依靠扩散的成像链很容易达到的短亲水性DNA对接链，也不能排除对接链的亚群仍然无法用于杂交，尽管积极地靶向可利用的蛋白质位点。这将导致系统的计数不足。为了排除这种可能性，已经执行了一些控制实验。应仔细考虑功能性生物分子的物理化学性质以及成像过程中涉及的分子间相互作用。

DNA-PAINT可以对颗粒间和颗粒内可用功能位点分布进行定量表征，为合理设计这些纳米材料提供了更多信息。对于许多纳米粒子来说，都发现了活跃站点的集群组织。多种物理化学原因可能是这种异质性的根源。立体障碍，蛋白质-蛋白质障碍或生物分子在颗粒表面的错误定向可能会降低位点对溶剂的均匀暴露，从而形成可识别的颗粒内以及颗粒间异质性。这种基于DNA-PAINT的作图方法通常适用于具有不同大小，形状或功能化系统的各种纳米材料，从而可以在单个分子水平上获得功能性纳米材料的直接定量表征。

要对这些方法进行验证，首先就要进行纳米粒子的制备，我们找到了一种制备SiO2纳米颗粒的简便方法[14]。通过制备出的二氧化硅纳米粒子，对表面进行抗体分子修饰，我们将按照文献[4]记载的验证方法对上文中提到的超分辨技术进行验证，总结基于纳米粒子的光学超分辨显微成像研究进展，提出研究纳米粒子表面生物识别分子密度的方法。

参考文献：

  1. E. Monachino, L.M. Spenkelink, A.M. van Oijen, Watching cellular machinery in action, one molecule at a time, J. Cell Biol. 216 (1) (2017) 41–51.
  2. M. Marchetti, et al., How to switch the motor on: RNA polymerase initiation steps at the single-molecule level, Protein Sci. 26 (7) (2017) 1303–1313.
  3. V. Aggarwal, T. Ha, Single-molecule fluorescence microscopy of native macromolecular complexes, Curr. Opin. Struct. Biol. 41 (2016) 225–232.
  4. Quantification of ligand density and stoichiometry on the surface of liposomes using single-molecule fluorescence imaging. Journal of Controlled Release, 2018, 278, 80–86
  5. N. Grimaldi, et al., Lipid-based nanovesicles for nanomedicine, Chem. Soc. Rev. 45 (23) (2016) 6520–6545.
  6. J.J. Otterstrom, et al., Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (48) (2014) E5143–8.
  7. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods, 2006, 3, 793-795
  8. Thompson, R.E., Larson, D.R. amp; Webb, W.W. Biophys. J. 82, 2775–2783 (2002).
  9. Nanoscale Mapping Functional Sites on Nanoparticles by Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography (PAINT). ACS Nano, 2018, 12, 7629minus;7637
  10. Agasti, S. S.; Wang, Y.; Schueder, F.; Sukumar, A.; Jungmann, R.; Yin, P. DNA-Barcoded Labeling Probes for Highly Multiplexed Exchange-PAINT Imaging. Chem. Sci. 2017, 8, 3080minus;3091.
  11. Dai, M.; Jungmann, R.; Yin, P. Optical Imaging of Individual Biomolecules in Densely Packed Clusters. Nat. Nanotechnol. 2016, 11,798minus;807.
  12. Quantifying absolute addressability in DNA origami with molecular resolution. Nature Communications, 2018, 9:1600
  13. Quantifying absolute addressability in DNA origami with molecular resolution. Nature Communications, 2018, 9:1600
  14. A facile method to prepare a series of SiO2@Au core/shell structured nanoparticles. Materials Chemistry and Physics, 2007, 105, 419–425

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