一、课题来源及选题依据
蜂毒是工蜂毒腺和附腺分泌出的具有芳香气味的一种透明毒液,贮存在毒囊中,蛰刺时由蛰针排出。其化学成分比较复杂,包括多肽类、酶类和非肽类物质。主要有效成分是蜂毒素、蜂毒神经肽、磷脂酶 A2、透明质酸酶、多巴胺和组织胺等。其中,蜂毒素是蜜蜂毒的主要成分,约占蜂毒干重的 50%[1]。蜂毒素是由26个氨基酸组成的小分子肽,相对分子质量为2849,为强碱性兼性分子,易溶于水[2-3]。蜂毒素具有很高的生物活性,现代药理研究表明它具有抗炎、镇痛、抑制血小板凝集、抗艾滋病及抗肿瘤等多种作用。近年来,有关蜂毒的抗肿瘤作用及其潜在的临床应用价值日益引起人们的重视。
由于蜂毒素毒性较明显,大剂量使用时对正常组织有一定的毒性作用,特别是溶血反应,限制了它在肿瘤临床的广泛应用。为了达到减毒增效之目的,有研究采用泊洛沙姆188将蜂毒素制成脂质体 ,作为一种膜表面修饰剂,其聚氧乙烯亲水长链镶嵌于磷脂双分子层中,降低了血浆蛋白的调理作用,减弱吞噬作用,延长药物在血中的滞留时间,达到减毒增效的目的[4-6]。比较了不同剂型蜂毒素的抗肿瘤效果,发现蜂毒素脂质体的毒性明显低于单纯蜂毒素,蜂毒素脂质体治疗组的肿瘤生长受到显著抑制,肿瘤组织坏死广泛,治疗后平均生存期延长,综合疗效优于单纯蜂毒素组[7]。表明蜂毒素脂质体延长了其对肿瘤细胞的作用时间,增强了抗肿瘤效应,同时减轻了蜂毒素对机体的毒性,表现出明显的减毒增效作用。
蜂毒素抑制肿瘤生长的机制: 1.直接杀伤肿瘤细胞。有研究应用胡蜂毒素对小鼠肿瘤模型(S180)进行肿瘤杀伤作用和治疗作用的实验研究,发现胡蜂毒对小鼠肿瘤细胞有直接杀伤作用和一定的治疗作用[8]。蜂毒主要活性成分蜂毒素体外对多种实验性肿瘤有具杀伤作用,并且 1 mol/L 浓度的蜂毒素,阻止肿瘤细胞的增生,而不抑制正常细胞的生长和克隆率[9]。通常认为蜂毒素使细胞线粒体膜溶解,使细胞的正常呼吸受到抑制,因而肿瘤组织氧化磷酸化的过程受到抑制,氧化功能被破坏,导致肿瘤组织生长抑制。2.免疫调节作用。国外早有研究报道蜂毒素参与抗肿瘤 T 细胞应答[10] 。蜂毒 0.32、0.63 mg/kg 能增加加 S180肉瘤鼠T 淋巴细胞酯酶阳性染色率,表明具有增强 T 淋巴细胞功能的作用。蜂毒 0.32 mg/kg 能增强 S180肉瘤鼠网状内皮系统(RES)对碳粒廓清能力,具有增强 RES 单核巨噬细胞的吞噬功能作用[11]。因此,推断蜂毒用于抗肿瘤治疗,其机理可能与增强 RES的吞噬功能和增强细胞免疫功能有关。蜂毒通过增强 Th1 细胞功能,对机体细胞免疫功能起正向调节作用,可能通过 Th1 类细胞,增强机体细胞免疫功能,因此,利用蜂毒对免疫系统的免疫调节作用,开展蜂毒治疗细胞免疫功能低下、肿瘤以及病毒感染等疾病研究具有重要意义[12]。此后,又有研究表明蜂毒对T淋巴细胞亚群的影响,结果表明,蜂毒对 T 淋巴细胞亚群起着双向调节作用,不管向哪个方向偏离,都呈现出回归正常范围的趋势,而对 T 淋巴细胞亚群处于正常范围的患者影响不大,认为蜂毒是理想的免疫调节剂[13]。3 .诱导肿瘤细胞凋亡。肿瘤的发生、发展不仅是细胞增殖和分化异常的结果,也与细胞凋亡受阻有关。细胞凋亡是细胞的一种不同于坏死的死亡方式,是细胞由基因控制的一种生理性死亡,同细胞的增殖、分化一样,是由基因控制的主动的细胞生物学过程[14]。近几年来有关蜂毒及其主要成分蜂毒素抗肿瘤的机制研究取得了新进展,众多研究发现蜂毒及蜂毒素的抗肿瘤生物活性是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。蜂毒素可抑制人肝癌BEL-7402、乳腺癌细胞系 MCF-7、T 淋巴细胞白血病 6T- CEM等细胞的生长并诱导其凋亡。
二、研究目的
本实验将研究蜂毒素脂质体的体内外抗肿瘤作用，确定其在细胞和小鼠肿瘤模型中的药效。本研究首先对蜂毒素脂质体进行体内外的临床前药效学研究，以确定其可能的疗效以及相对于蜂毒素单体的减毒增效的优势；同时对其治疗肿瘤的免疫调节机制进行更深入的探索，使我们对其作用的过程和在免疫反应网络中的靶点有更多的了解，最后更好的指导临床研究。
三、拟采取的研究方案
3.1 MTT法检测蜂毒素脂质体对Bel-7402人肿瘤细胞株的增殖抑制作用及IC50。
（1）细胞消化、计数、接种于96孔板中，细胞密度：0.8～1.5104个/100mu;l；
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