开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
本课题主要研究大精酸（Argirein，AR）对高糖诱导的血管内皮细胞凋亡的抑制作用。大精酸是一种利用超分子化学共晶技术制成的大黄酸精氨酸的复合物，即活性药物成分大黄酸（rhein）和共晶形成物L-精氨酸(L-arginine)形成的共晶物。这种大精酸共晶物具有缓释、长效、低毒的优势，与传统大黄酸类物质、大黄酸衍生物及大精酸复合物a、b相比，具有增加药物的溶解度和溶出度、提高稳定性、减少引湿性、提高生物利用度、改善释放特性等优势。该药物现主要用于治疗糖尿病并发症，包括：糖尿病心肌病，糖尿病大血管病变，糖尿病肾病，糖尿病性男性性功能低下（睾丸病和阳痿），糖尿病视网膜病，糖尿病神经病变的治疗，药效优良且安全。大精酸作用于糖尿病血管并发症的主要机制是由于NO的缺乏导致血管舒张功能减弱，而大精酸在体内释放L-精氨酸，作为NO的前体药物，可生成NO。大黄酸和精氨酸形成的新化合物，具有双重作用：一方面，大黄酸抑制多种抗炎性因子：NFkappa;B，TNFalpha;，ROS，EGF等，对内皮素系统调控，具有对抗炎症因子和对抗内皮素受体的作用；另一方面，精氨酸作为前体药物，提供NO，能够直接保护血管舒张功能，具有协同作用，起到加强药效的作用。因此，大精酸可明显减轻内质网应激，供应额外的NO，有利于对抗大血管和微血管并发症发生，使血管恢复正常。大精酸对治疗糖尿病并发症显示出优良的药理作用[1-2]。
细胞凋亡（apoptosis），即程序化的细胞死亡（Programmedcell death, PCD）,是一种不同于细胞坏死的生理性或病理性的死亡过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等多个方面。细胞凋亡伴随着独特的形态与生化改变，其中细胞核的形态改变最为突出，形态上表现为胞膜形成泡状突起，染色质浓缩，细胞核裂解，核染色质DNA降解为180-200bp及其整倍数的片段，在琼脂糖凝胶电泳时，DNA呈典型梯状带。在此过程中，有caspase-3等效应分子的激活，活化的caspase可裂解破坏细胞的必须成分，如细胞骨架和DNA,并通过降解作为DNA损伤修复的传感分子多聚ADP-核糖聚合酶（PARP）、降解参与DNA损伤修复的DNA依赖性的蛋白激酶（DNA-PKs）和降解DNA损伤的传感分子ATM以及不均质核核糖核蛋白（hnRNP）而抑制DNA的修复能力或RNA或蛋白质的合成作用，从而引起DNA的断裂、染色体浓缩而细胞凋亡。因此，细胞被诱导发生凋亡时，抗凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w表达降低，促凋亡相关蛋白Bax、Bad、Bak、Bik表达量相应增加，与此同时，凋亡效应分子caspase-3/6/7/8/10等活性增强[3-4]。目前研究认为，细胞凋亡在器官发育、伤口愈合、免疫反应等过程中调控细胞增殖与更新间的平衡，维持组织器官正常生理功能及细胞数量的相对稳定。
生理状态下，高胰岛素血症、AGE、血管紧张素-Ⅱ、氧化的LDL、活性氧（reactiveoxygen specie，ROS）以及炎症细胞因子等多种因素均可诱导血管内皮细胞发生凋亡。研究证实，高糖诱导活性氧的产生，而活性氧进一步能引起细胞功能失调，甚至细胞死亡，探究细胞凋亡在研究高糖对内皮细胞损伤过程中具有重大意义。同时，在分子生物实验中，可以通过提高培养基的D-Glucose浓度，模拟高糖环境，诱导细胞凋亡。而选择大鼠主动脉血管内皮细胞（RAEC）作为实验对象是由于血管内皮细胞是高血糖损害的一个重要的靶器官。正常内皮细胞具有多重生物学功能，包括：保持血管正常张力，拮抗血栓形成，活跃的内分泌功能，强大的屏障作用，抗血管平滑肌细胞增殖，抑制白细胞的粘附，抑制管壁炎性反应，调控血小板等。研究证明血管内皮细胞功能异常是血管并发症发生的重要因素，高血糖可通过多种途径导致血管内皮细胞功能不全[2]。
本课题计划体外模拟高糖环境，诱导RAECs产生一定程度的凋亡，形成凋亡模型。模型建立后，给予治疗药AR，检测给药后RAECs的凋亡程度，探究AR对RAECs凋亡的影响。细胞凋亡的变化可通过Westernblotting（WB）方法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3的表达，也可通过流式细胞仪检测凋亡程度，本课题计划先使用WB方法筛选高糖与大精酸的浓度与时间，再通过流式验证凋亡程度。流式细胞仪采用Annexin/V-FITC凋亡试剂盒检测，Westernblotting具体步骤如下：
1、细胞总蛋白提取：取对数生长期的RAEC细胞，细胞贴壁率达90%左右，将细胞离心，PBS冲洗3次后每瓶加入RIPA裂解液100mu;l，吹打均匀后充分裂解，离心后收集上清。
2、BCA法测蛋白浓度
3、SDS-PAGE分离胶的制备：
①将制胶用的玻璃板玻璃板清洗干净，风干，固定在制胶槽上，注意两块玻璃板中位置较低的一块应朝向电泳槽的阴极侧；
②根据所跑目的蛋白分子量大小，配制12%的分离胶5ml和浓缩胶（5%）2ml。
以上是毕业论文文献综述，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
