- 选题背景及研究概述
近年来，随着医学的不断进步，恶性肿瘤在一定程度上得到控制，但其仍是人类健康的一大威胁，是潜藏的“杀手”[1, 2]。化学治疗、放射治疗和手术治疗被认为是治疗肿瘤的首选方法，其中，化学治疗（化疗）也叫做药物治疗，是一种全身治疗的手段，化疗药物通过“细胞毒”作用杀伤肿瘤细胞[3]，在肿瘤治疗中占重要地位，是目前治疗肿瘤最有效的手段之一。但其非特异性杀伤对正常组织产生很大的毒副作用，限制了它的应用[4]。而最近免疫治疗也受到了人们的关注，这是一种通过调节免疫微环境，激活人体自身免疫系统来对抗肿瘤的治疗手段[5]，与传统治疗方法相比有不可比拟的优势。然而免疫治疗有明显的复杂性和不确定性，可能出现免疫系统过度活跃而引起严重不良反应。有研究表明，如果能够充分利用化学治疗与免疫治疗各自的治疗优势，在抗肿瘤方面会产生强有力的协同作用[6]。联合化学免疫疗法的概念探索了这样一个事实，即用化学疗法进行治疗不仅可以降低肿瘤细胞负荷，而且可以中和肿瘤诱导的免疫抑制，从而促进免疫疗法的效果[7]。
聚乙酰胺-胺树枝形聚合物（Polyamidoamine，PAMAM）作为一种具有均匀分子结构的纳米级化合物，是目前研究较为广泛的树枝状大分子之一。树状大分子的结构可分为三部分：1.核心，是树状分子生长的固定点；2.内层和内枝，根据层数的不同分为不同的代数；3.外层，作为终端功能化分支，可作为潜在反应点[8]。PAMAM树枝状大分子具有独特的性质，包括三维结构、多功能表面和内部空腔以及纳米级别的尺寸，它可以促进和调节药物传递过程[9]，且无免疫原性、具有较好的稳定性[10]等，这些性质促使PAMAM成为新型的抗肿瘤药物递送载体[11]。Svenson, S.[12]等人发现与游离顺铂相比，包裹在PAMAM树状大分子中的顺铂释放更慢，在实体肿瘤中积累更多，毒性更低。难溶性药物心得安经PAMAM-G3修饰后，药物水溶性提高并增加了细胞转运能力[13]。然而PAMAM表面存在大量氨基，使其带有正电荷，较高的正电性导致了很强的细胞毒性。因此，为了提高PAMAM的生物相容性，必须对其进行表面修饰[14]，而大量的氨基也是对其进行表面修饰的基础，并在药物传递中起着重要的作用。
透明质酸（Hyaluronic Acid，HA）是一种天然的粘多糖，由D-葡萄糖醛酸(GlcUA)和N -乙酰-d-葡萄糖胺(NAG)的糖残基交替组成[15]，具有可生物降解、无毒、无免疫原性、生物相容性良好等物理化学和生物学性质[16]。据报道，根据透明质酸分子量的不同可将其分为透明质酸寡糖 (o-HA, lt;25个双糖单元)、低分子量透明质酸(LMW-HA，10～100kDa)、高分子量透明质酸(HMW-HA，gt;100kDa)[17]，不同相对分子质量的透明质酸在生物体内可以发挥不同的作用。高分子量HA在修复、炎症和肿瘤过程中占主导地位，可促进细胞增殖、粘附和运动,但是会抑制促炎介质的产生[18]，对肿瘤具有免疫抑制作用[19]，使肿瘤恶化。大量文献指出，低分子量HA可激活先天免疫应答过程，引起巨噬细胞表型变化[20]。Ghatak [21]等研究发现，o-HA在体外能够对大鼠C6神经瘤细胞、人LX1肺癌细胞、人HCT克隆细胞的增长具有较强的抑制作用, 抑制率能够达到50%~100%，低分子量HA和透明质酸寡糖的这些特点对肿瘤治疗具有极其重要的意义。为了实现HA在肿瘤部位的治疗功能，其可被在多种肿瘤细胞表面过表达的特异性受体CD44识别，如胰腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌等[22]。因此基于HA的药物递送系统可以通过EPR效应和CD44介导的主动靶向效应，在肿瘤组织大量积累[23，24]。并且HA分子结构中具有丰富的羧基、酰胺基等基团，可以通过酰胺化、开环、酯化、等方法对这些修饰位点进行化学改性。基于透明质酸的上述特点，我们可以利用低分子量HA修饰PAMAM，不仅可以实现PAMAM表面电荷的中和，降低其固有细胞毒性[25]，也能更好地实现肿瘤靶向并提高肿瘤细胞对载体的有效摄取。
实体肿瘤不仅包括恶性细胞，还包括许多其他非恶性细胞类型，这产生了一个独特的微环境[26]，包括细胞外基质、成纤维细胞、内皮细胞和炎性反应细胞等。其中免疫抑制性细胞对肿瘤的侵袭、转移和免疫逃逸起到了关键作用，而肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages，TAMs）是免疫抑制细胞中重要的一员[27]。TAMs在不同的组织环境发生特异性分化，可分为两种不同的极化状态，即经典活化的（Activated macrophage，M1型）巨噬细胞和替代性活化的（Alternatively activated macrophage，M2型）巨噬细胞[28,29]。M1型巨噬细胞可识别肿瘤细胞并通过相应的信号通路，释放出NO（一氧化氮）、ROS（reactive oxygen species,活性氧簇）等肿瘤杀伤因子，直接杀灭肿瘤细胞，参与抗肿瘤的免疫过程[30]。但M2型巨噬细胞分泌促肿瘤细胞因子（如IL-4、IL-10、IL-13），改变基因表达（如上调缺氧诱导因子（HIF）、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶7 （MMP-7）），促进肿瘤进展[31]。肿瘤部位的TAMs倾向于M2表型，抑制免疫清除，促进肿瘤细胞增殖，刺激血管生成从而促进肿瘤细胞生长[32]。目前，由于巨噬细胞大量存在于肿瘤部位，而且表型转化的内在机制为巨噬细胞提供了免疫重塑的先决条件，将免疫抑制表型的M2表型TAMs转化为M1表型的抗肿瘤细胞已经成为很好的治疗靶点。Jamie E[33]等观察了不同分子量的HA对巨噬细胞极化的作用，发现低分子量HA可能通过Toll样受体发出信号，产生与经典激活相关的细胞因子和上调标记，使巨噬细胞易于向M1型转化。受此启发，基于低分子量HA修饰的PAMAM纳米载体不仅可以实现肿瘤靶向，也能利用透明质酸复极化TAMs实现肿瘤免疫微环境的重塑，达到免疫治疗的效果。
众所周知，肿瘤微环境具有低酸、低氧、高间质压力的特征，其中缺氧是实体肿瘤的一个重要标志。在缺氧微环境中,肿瘤细胞能够通过改变代谢方式,抑制免疫细胞的抗肿瘤作用,易于发生侵袭、转移和激活耐药基因等途径提高自身的适应能力[34,35]。缺氧微环境提高了肿瘤的恶性程度和肿瘤治疗的困难程度。肿瘤细胞对缺氧的适应是通过一种异二聚体转录因子-1 (HIF-1)介导的[36]，而本课题使用的模型药物BAY 87-2243是一种有效的HIF-1抑制剂，许多小鼠肿瘤模型的临床前研究显示，BAY 87-2243对肿瘤生长有中度至高度的抑制作用[37]。
综上所述，本项目以修饰有低分子量透明质酸的树枝状聚合物PAMAM作为载体，将抗肿瘤药物HIF-alpha;抑制剂BAY87-2243药物通过肿瘤部位所表达的CD44受体靶向递送至肿瘤部位。低分子量HA可以介导载体被肿瘤细胞内吞，响应胞内透明质酸酶-1的作用，被降解为低聚糖o-HA释放药物发挥其肿瘤治疗效果。与此同时，被降解的HA寡聚糖片段还可以促进肿瘤相关巨噬细胞从具有肿瘤免疫抑制作用即促肿瘤的M2型复极化为具有促炎作用即抗肿瘤的M1型，并促进其分泌抗肿瘤相关的细胞因子，通过重塑肿瘤微环境以实现化疗和免疫治疗的联合效应。
- 预期目标
选用符合体外分析方法要求的含量检测方法测定药物含量，制备理化性质良好，安全无毒的纳米载药系统，提高载体的肿瘤靶向效率并实现载体在肿瘤内部良好的穿透作用。
- 研究手段
1、BAY 87-2243的处方前研究
建立该药物的处方前研究，包括平衡溶解度的测定、不同介质中的溶解度测定、含量检测方法的建立等。
2、HA-PAMAM载体的合成、纯化与鉴定
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