开题报告
一．研究目的
基于已有的检测数据分析尝试开发一种蛋白电荷异构体的分离纯化方法
二．研究内容
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。
单克隆抗体是复杂的四聚体糖蛋白，常呈现出不均一性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构体。异质性可能来自于抗体分子复杂的生物合成途径，（如细胞系及培养工艺影响糖基化）也可能来于纯化，制剂工艺中产生降解或聚体。其中由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性称为电荷异构体，一般分为酸性异构体和碱性异构体。这些电荷异构体的形成可能发生在产品的整个生命周期的任何阶段。电荷异构体宏观表现为等电聚焦电泳图上出现弥散或多个条带；离子交换色谱图主峰前后出现小峰。单克隆抗体药物的相对分子量约150 kDa ,作 为复杂的大分子物质在细胞培养、纯化、运输、存储过程中可能在组成氨基酸、二硫键、糖基化等层面发生不同程度的变化进而引起电荷的变化。电荷异构体的产生原因主要包括C-末端赖氨酸截除，N-末端谷氨酰胺/谷氨酸环化作用，N糖基化，氧化，半胱氨酸残基，分子片段和多聚集引起的异质性等。不同原因产生的电荷异构体所带来的电荷性质的变化、对单抗生物活性的影响以及相应的控制策略均不相同。在上游细胞培养过程中，随着培养时间的延长，抗体的浓度逐渐升高；与此同时，酸性电荷异构体的比例也逐渐升高。因此我们需要在抗体上游培养的浓度和下游的回收率之间进行平衡，来确保抗体产品的质量。
目前报道的单克隆抗体电荷异质体包括天冬氨酸异构化、天冬酰胺的琥珀酰氨化、蛋氨酸及苯丙氨酸的氧化、末端唾液酸化、C-末端赖氨酸缺失/增加、N-末端谷氨酸环化、半胱氨酸二硫键错配等。适用于单克隆抗体的电荷异质体的分析方法有多种，包括阴、阳离子交换色谱法、毛细管等电聚焦电泳、成像毛细管等电聚焦法等
由于单克隆抗体电荷异质体可能对产品的有效性造成影响，因此需控制其在产品中的含量。同时单克隆抗体电荷异质体也可反映生产工艺的一致性等信息，因此单克隆抗体的电荷异质体是药物放行的重要检测项目之一。电荷异质体的分析方法中离子交换色谱是常用的分析检测手法。离子交换色谱（IEC）是基于生物大分子的表面电荷分布状态的差异进行蛋白分离分析的一种分析方法，通过该技术手段，可快速得到样品的不同电荷分布信息。同时，也可利用半制备离子交换色谱柱对样品的各酸碱峰进行一定程度的细化富集，为下一步的鉴定提供保证。
三、研究手段
电荷异构体的层析去除策略
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