开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是用人工方法将缺乏多分化潜能的成熟体细胞转变为具有强大的自我更新和分化潜能的一类细胞。由于诱导多能干细胞来源于患者自身体细胞，不受伦理、宗教、法律等的限制，且在根本上消除了患者的排斥反应，故与胚胎干细胞特性相似的iPSCs具有极高的研究价值和广阔的临床应用前景。2006年，日本科学家Yamanaka等首次利用病毒载体将4个重要的转录因子Oct3／4、Sox2、cMyc和Klf4基因转入小鼠尾部成纤维细胞中，使其重编程得到类胚胎干细胞诱导多能干细胞[1]。2007年Takahashi又成功地将成人皮肤成纤维细胞( human dermal fibroblast，HDF)重编程得到人源诱导多能干细胞（hiPSC）[2]，为细胞发育分化调控、疾病模型、药物筛选、临床治疗等提供了有效的研究平台。
近年来研究者们成功将多种人的不同类型细胞，采用多种方法诱导为iPSCs。成纤维细胞是实验室获取iPSCs最常用的来源，但它们需要经过皮肤活检和细胞扩培来获得足够的细胞。而外周血单核细胞（PBMC）的优势在于获取简单，需求量少，获得的iPSCs分化成造血谱系的效率更高，较成纤维细胞更适用于研究心血管系统的实验[3]。将PBMC重编程为诱导多能干细胞多使用整合病毒、非整合病毒或DNA载体[4-7]。仙台病毒（SeVs）是一种负性单链RNA病毒，仅在细胞之中复制，不整合到宿主DNA中，且对人类没有致病性，是重编程的理想工具[8]。采用编码Oct4、Sox2、cMyc和Klf4的SeV重编程少量血液样本来源的PBMC获得iPSCs，是构建实验用iPS细胞株的科学有效的方法。虽然iPSCs离实际应用于临床治疗还有很长的路要走，但随着细胞生物学、分子生物学、发育生物学、功能基因组学及转基因技术的进一步发展，可预见iPSCs在细胞移植治疗、药物筛选和发病机制研究等方面将发挥重要的作用。
心血管疾病是一种严重威胁人类健康的常见病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。hiPSC来源的心肌细胞可用于移植到心血管疾病的动物模型中，监测其与自体心肌细胞的整合状况、对损伤坏死细胞的治疗效果[9]，为心血管疾病的历程研究及治疗方法提供新的思路。iPSCs定向诱导分化为心肌细胞有多种途径：一是利用体外的机械牵张力刺激干细胞以提高其向心肌细胞分化的效率 [10]，二是利用小分子物质对干细胞进行化学诱导[11]，三是导入定向分化相关的表观遗传修饰因子诱导诱导多能干细胞向心肌细胞分化[12]，四是在分化过程中添加细胞因子促进心肌分化[13]。经各途径优缺点和可操作性的比较[14]，本实验拟采用安全可控、难度较小的细胞因子诱导途径诱导iPSCs定向分化为心肌细胞。
构建好的心肌细胞株移植入动物模型后，需长期观察其整合情况和治疗效果，这要求监测方法有可重复性且对动物无损伤。生物发光成像检测(bioluminescence imaging，BLI) 具有操作简单、信噪比高、检测仪器相对经济、特异性强、灵敏度高、成像质量高、发光强度可精确定量等优点，且不影响动物的正常生理功能，可连续性观测[15]。萤光素酶基因(luciferase, Luc)是应用最广泛的在体生物发光成像报告基因之一，将Luc基因通过反转录病毒感染到iPSCs，筛选出稳定表达的细胞株，可诱导分化出产生萤光素酶的心肌细胞，移植入动物模型后利用BLI技术进行后续检测[16]。
本实验拟利用PBMC经仙台病毒感染，重编程为安全稳定遗传、分化潜能大的iPSCs。构建好的iPSCs株通过病毒感染萤光素酶基因，再经过药物筛选、PCR验证获得含萤光素酶基因可稳定遗传的iPS细胞株。iPS细胞株以细胞因子诱导途径定向分化，得到荧光表达的心肌细胞株。即最终目标为获得荧光表达的iPS细胞株和心肌细胞株。
重编程实验利用CPT管从血样中提取PBMC，培养一段时间观察细胞形态正常活性良好后，选用编码Oct4、Sox2、cMyc和Klf4的SeV感染，重编程后约40天，将形态、生长状况良好的克隆单独培养，再利用磁珠分选技术进一步筛选优化，得到可用于后续实验的iPSCs。
感染实验选用阴性对照病毒CON101（Ubi-MCS-Luc-IRES-Puromycin）和50代hiPSC。该病毒既存在目标萤光素酶基因，又含有Puromycin选择性基因，提供了筛选条件。而50代的诱导多能干细胞已发育成熟，有较强的生长繁殖能力和分化干性，感染过程中细胞死亡概率较小，分化过程成功率较大。正式感染实验前需进行预实验，确定病毒对细胞的感染MOI和最佳的感染条件，参考预实验的结论确定正式实验的病毒浓度和感染条件。
筛选实验主要分为Puromycin（嘌呤霉素）药筛和RT-PCR验证两部分。Puromycin药筛即以嘌呤霉素为筛选条件，用未经感染的同来源iPSCs做预实验，确定嘌呤霉素的（最小作用浓度），正式实验设置未经感染的同来源iPSCs作为空白对照组，感染后的iPSCs作为实验组，分别用含适宜浓度的嘌呤霉素的培养基培养，因感染后的iPSCs同时含有Luc基因和Puromycin基因，能够在使正常细胞死亡的嘌呤霉素浓度下存活，以此筛选出有荧光表达的iPS细胞株。rt-PCR即反转录PCR，包括反转录过程和PCR过程。利用已有的试剂盒将RNA提取出来，再用特定病毒的反转录酶将RNA反转录为DNA，最后进行PCR放大该反转录的DNA片段，以达到检测特定RNA含量的目的。
分化实验以构建好的荧光表达的iPS细胞株为起点，经扩培、诱导分化、纯化得到荧光表达的心肌细胞。心脏是由心肌细胞和非心肌细胞（如成纤维细胞和血红细胞）组成的，体外培养时心肌成纤维细胞较心肌细胞更易贴壁和增殖，容易生长成优势细胞，对心肌细胞的生长产生密度抑制。研究发现利用低浓度的胰蛋白酶与胶原酶联合应用、多次消化心脏组织，通过差速贴壁90min、CMM培养基的使用，可以有效的分离心肌细胞和心肌成纤维细胞[17]，提高心肌细胞的纯度。分化纯化得到的心肌细胞株经生物发光成像检测确认其具有荧光表达，即达成本次实验的最终目的：构建人源诱导多能干细胞来源的心肌细胞荧光表达的细胞株。
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