一、课题概况
柴胡是柴胡科柴胡属植物北柴胡的根，我国药典规定北柴胡（Bupleurum chinese DC.）和狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.)为正品供使用。柴胡味辛、苦，性微寒。具有和解表里，疏肝解郁，升阳举陷，退热截疟等功效。可以用于治疗感冒发热，寒热往来，胸胁胀痛，月经不调，子宫脱垂，脱肛。八十年代以来，许多科研工作者对柴胡提取物或其主要化学部位的药理作用进行了较为深入的研究。近年来研究发现柴胡皂苷具有镇定、镇痛、降温、镇咳、抗炎、保肝、抗肿瘤、抑制组胺等作用。其中，柴胡皂苷a和d的活性最强。柴胡皂苷d（SSd）是三萜皂苷，属于齐墩果烷的衍生物，结构中具有环氧醚键，是柴胡中的原生苷，母核的3位连有岩藻糖和葡萄糖。
。通过药物在动物体内的代谢和药代动力学研究证实，柴胡皂苷可在大鼠体内经肠道菌转化成代谢产物后才能被吸收并发挥其药理作用。从人粪便中分离水解柴胡皂苷的菌株，肠道菌E.S. P.A-44，S.P.Saiko-1和Saiko-2显示出较强的葡萄糖苷酶活性, 能将柴胡皂苷a,b1,b2和d 水解成相应的前柴胡昔元F.A、D 和G,而其中仅E.S. P.A-44菌株含有新型beta;-D岩藻糖苷酶, 能将前柴胡皂苷水解为柴胡苷元。本实验通过酶解实验，利用高效液相色谱和质谱等手段，研究柴胡皂苷d酶解特征，并初步判断酶解产物的结构。
二、研究方法
1.糖苷酶的选择
柴胡皂苷（五环三萜）与人参皂苷（四环三萜）相似，3位连有糖基。通过查阅文献，选择多种能够水解人参皂苷的糖苷酶进行柴胡皂苷d的温孵实验。分别是：beta;-葡萄糖苷酶（来源于杏仁），beta;-葡萄糖苷酶（来源于黑曲霉），beta;-半乳糖苷酶（来源于大肠杆菌），葡萄糖淀粉酶（来自黑曲霉），蜗牛酶（来自蜗牛），硫酸酯酶（来自蜗牛），人肠菌酶。
- 温孵实验方案
空白试验1：玻璃管2个，分别加200mu;l酶液(1.23mg/ml)，37℃预孵10min，加入磷酸缓冲液（PBS）5ul，温孵12h。
空白试验2：玻璃管2个，一管内加入PBS200ul，37℃预孵10min，另一管内加SSd母液(0.5mg/ml)5mu;l，37℃预孵5min。之后将5ul的SSd母液加到PBS中，孵育12h。
酶水解试验：玻璃管2个，分别加200mu;l酶液A(1.23mg/ml)，37℃预孵10min，SSd母液(0.5mg/ml)5mu;l预孵5min，把SSd母液加入到酶液中，37℃共孵12h。
- 孵育后样品的前处理方法
温孵后的样品，加入1ml正丁醇，涡旋5min，3500r，离心10min，取上清，N2吹干，100ul流动相（甲醇—水：80:20）复溶，高速离心10min，16000r，取上清HPLC—UV分析。
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