开题报告内容：
- 研究目的与意义
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）具有多种功能，它与特异性的受体结合，刺激细胞的增殖，促进血管的形成。研究表明多种实体瘤VEGF过表达与肿瘤血管生成以及分化和进展过程密切相关,利用VEGF单抗抑制VEGF活性可显著抑制实体瘤的生长[1]。在众多肿瘤诱导的血管生成因子中，VEGF 是最主要的、特异性最强的一种内皮细胞生长因子。由于在胚胎发育初期机体即对其产生免疫耐受，因而作为一种肿瘤相关抗原，VEGF 具有抗原性弱的特点[2]。用单克隆抗体封闭VEGF与受体结合,抑制肿瘤血管新生实现肿瘤治疗取得了临床有效的结果[3]。为进一步提高抗体的免疫原性，设计了一种全人源VEGF抗体双突变体，通过HEK293真核细胞表达系统合成VEGF抗体并测定其亲和常数。针对高抗原结合活性的全人源VEGF抗体研究对肿瘤药物的开发具有重要的意义。
- 国内外研究现状
纵观近年来的肿瘤治疗，抗血管生成的治疗方式饱受争议。自1975年肿瘤性血管生成概念的首次提出，到1986年发现血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）及 其 受 体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR），1997年首次合成了针对VEGF的抗体——贝伐单抗，抗血管生成终于从实验室走进临床，也首次提高了晚期结直肠癌 30％的总生存率（Hurwitz，et al. NEJM 2004）和晚 期 肺 癌 19% 的 总 生 存 率（Sandler，et al. NEJM2006）。国内的重组人血管内皮抑素也在肺癌治疗中获得成功。2004 年bevacizumab （商品名Avastin）经 FDA 批准在美国上市，与化疗药物联合使用，作为治疗转移性结直肠癌的一线药物，成为第一个抗肿瘤血管生成药物[4]。然而，从 2010 年开始，其不良反应、疗效和临床性价比等不断成为质疑的焦点。首先是美国食品药品监督管理局（FDA）发现贝伐单抗仅能延长“三阴”乳腺癌的无进展生存率（progression freesurvival，PFS），却不能延长总生存率（overall survival，OS），而撤回了贝伐单抗治疗HER2阴性乳腺癌的适应证。继而，著名的评论机构NICE指出，其成本效益较低，20 800英镑仅延长结直肠癌患者6周的生存时间。国内专家吴一龙也提醒，贝伐单抗延长 PFS缘于用药，其PFS竟与用药时间几乎相等。此后，研究者们又组织了PRONOUNCE、POINTBREAK 等多个临床试验，以探索贝伐单抗是否延长OS[5]。
VEGF抗体药物作用VEGF通路上不同靶点有多种类型，除了抗VEGF单抗，还有抗VEGFR抗体,Ramucirumab 是唯一已上市的抗 VEGFR2 的全长人源 Ig G1 单抗，可特异性地结合 VEGFR2的胞外域并阻断 VEGFR2相关的信号通路。在各种实体瘤开展广泛试验的 Ramucir-umab，已作为胃癌与非小细胞肺癌的治疗用单抗被 FDA 批准上市，但在数个Ⅲ期临床试验中，并未取得转移性乳腺癌及肝癌 OS 的改善。其他的抗VEGFR抗体包 括以VEGFR-2为靶点的tanibirumab、sevacizumab、GNR-011以及以VEGFR-3为靶点的mF4-31C1，在临床前的动物模型上均表现出不同程度的抗肿瘤以及新生血管活性。再有双特异性抗体，目前在研的以 VEGF 为靶点之一的双特异性抗体有两种，一种是由 Roche 开发的，以血管生成素 2( Ang-2) 以及 VEGF 为靶点的单抗 RG-7221，临床前发现具有抑制肿瘤血管生成、肿瘤细胞传播以及移植瘤生长等活性;； 另外一种是抗 DKLL-4 /VEGF 单抗，其中包括由 Cel-gene 和 Onco Med 共同开发的 OMP-305B83，以及由Abb Vie 开发的 ABT-165，目前未有相关文献报道。
三、研究方法和手段
（1）采用瞬时转染的方法把带有突变基因的质粒转染入HEK293t细胞；
（2）培养细胞，选择最佳培养时长，收集上清；
（3）利用全抗体Fc段能够与Protein A特异性结合的特性，进行Protein A柱亲和层析，纯化突变抗体；
（4）用BCA比色法测定抗体浓度，电泳法测定还原和非还原抗体的纯度；
（5）ELISA法初步测定抗体的活性；
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