开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 拟研究的问题
Oct4属转录因子POU家族成员，它在维持胚胎干细胞的增殖与分化潜能方面起关键作用。近来研究发现，Oct4在乳腺癌、肺癌等多种实体瘤中有表达，其功能可能与肿瘤干细胞紧密有关。
shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，通过RNA干扰的原理靶使基因沉默。通过设计Oct4-shRNA，构建表达载体，达到将肿瘤细胞中Oct4沉默的目的。
因此，本实验先要设计针对Oct4的shRNA，构建表达载体，最后进行功能验证，为肿瘤干细胞研究奠定基础。
二．实验目的
本实验主要通过构建针对Oct4的shRNA的表达载体，并进行功能验证，为肿瘤干细胞研究奠定基础。
三．材料和仪器：
1. 样品和标准品
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Oct4-shRNA表达质粒pGPU6-RFP |
本实验室制备 |
2. 材料和试剂
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胰蛋白酶 |
Biosharp公司 |
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DMEM |
Gibco公司 |
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EDTA |
南京化学试剂有限公司 |
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十二水合磷酸氢二钠 |
西陇化工股份有限公司 |
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NaCl |
西陇化工股份有限公司 |
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乙醇 |
国药集团化学试剂有限公司 |
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娃哈哈纯净水 |
杭州娃哈哈百立食品有限公司 |
3. 实验仪器
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CO2细胞培养箱 |
美国Thermo公司 |
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倒置显微镜 |
上海测维光电技术有限公司 |
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超净台 |
苏州净化设备有限公司 |
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电子天平（d=0.01mg） |
Sartorius BT25S |
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数显恒温水浴锅 |
国华电器有限公司 |
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离心机 |
上海安亭科学仪器制造厂 |
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PCR仪 |
My geneTM Series Peltier Thermal cycler |
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超纯水制造仪 |
成都超纯科技有限公司 |
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凝胶成像仪 |
南京麦高德生物科技有限公司 |
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电泳仪 |
六一 |
四．实验方法
按照shRNA设计原则，合成Oct4-shRNA，连入shRNA表达载体pGPU6-RFP，转入感受态细胞并进行阳性筛选,提取质粒进行验证。
验证方法：
1.重组质粒测序验证序列的正确性
2.免疫荧光验证重组质粒能否在细胞内表达
3.RT-PCR在mRNA水平验证shRNA表达质粒有没有发挥沉默Oct4mRNA表达
4.Western Blot在蛋白水平验证shRNA表达质粒能否沉默Oct4蛋白的表达
五．文献综述
Oct4基因结构及功能简介
[摘要] Oct4基因是POU转录因子家族中的一员，主要表达于胚胎干细胞、生殖干细胞以及未分化胚胎癌中，对于维持干细胞的多潜能性和自我更新能力具有极其重要作用。本文简要介绍了Oct4的基因结构以及在胚胎干细胞和癌症发生中的作用，为了解Oct4提供便利。
[关键词]：Oct4；胚胎干细胞；肿瘤干细胞；多能性
哺乳动物在胚胎发育过程中受着多种基因的严密调控，以保证其有序地进行组织分化和个体发育。Oct4基因就是其中一个关键基因，也被称为Oct4、POU5F1、OTF3或OTF4，是POU转录因子家族中的一员。近来研究发现，Oct4在乳腺癌、肺癌等多种实体瘤中有表达，并认为其功能可能与肿瘤干细胞有关。
1.Oct4基因结构
人的OCT4基因位于6号染色体上（6p21.31），长度为16.40 kb，具有多个转录起始位点，转录不同的mRNA亚型，从而翻译成多种蛋白质。目前人Oct4基因共有11种亚型，翻译7种蛋白质。OCT4 Isoform 1是转录的主要亚型之一，具有5个外显子、4个内含子，翻译的蛋白质含有一个保守的DNA结合结构域——POU结合域，它能与含八聚体基序（octamer motif）的DNA结合从而调控下游靶基因的转录[1]。
2.Oct4的功能
2.1在维持和重获细胞多潜能性中的作用
多能性，细胞在哺乳动物植入前胚泡的内细胞团以及胚胎干细胞的特征，即指一个细胞能够产生一种生物体所有类型的细胞的能力。转录因子家族对于建立和维持多能性状态是很必要的。最近研究已经表明，已分化的体细胞通过一系列转录因子的过表达能够重新获得多能性，进一步显示出转录因子在控制细胞多能性方面的重要性。在这些因子中， Oct4，是控制多能性的重要部分。Oct4高表达于多能性细胞中而在已分化细胞中沉默。有趣的是，Oct4表达的精确水平决定了胚胎干细胞的命运。因此，为了控制Oct4表达的精确性，进行了各个水平上的多种调控，包括转录，mRNA翻译以及翻译后修饰。此外，与SOX2， Nanog的和核心转录调节通路中的其他成员合作， Oct4激活蛋白质编码基因和多能性必需的非编码RNA。同时，与转录抑制复合物共同作用，Oct4抑制其他一系列与发育过程有关的靶点。重要的是，Oct4可以重新建立体细胞的多能性， Oct4表达的正确再编码对于获得真正的诱导多功能干细胞系必不可少[3]。在过去的几年里，Oct4靶基因的全基因组鉴定和以Oct4为中心的蛋白质相互作用组已经被报导，指出Oct4严格控制多能性调控表达和保护胚胎干细胞处于未分化状态[4]。然而，进一步研究要求对Oct4维持和重获多能性作用潜在的分子机制进行充分阐述。对该蛋白质复合物和与Oct4有关的靶基因进行系统性及动态探索将会有助于更全面地阐明Oct4的作用。
体外研究发现,Oct4随着组织细胞的分化其表达降低或消失。此外,通过沉默Oct4基因,鼠和人胚胎干细胞会向滋养层细胞分化,这种维持胚胎干细胞多潜能性的功能是剂量依赖性的[2]。研究发现,Oct4基因表达量的升高或降低,都会引起胚胎干细胞的分化,而且这种调节是极其精细的,小于2倍基础量可以使胚胎干细胞分化成滋养外胚层细胞,大于2倍的基础量可以使胚胎干细胞分化成中胚层细胞。
2.2 Oct4在肿瘤中的作用
研究发现胃癌、神经胶质瘤、肝癌、卵巢癌、肺癌及膀胱癌等多种肿瘤中均有oct4的表达，维持肿瘤细胞的未分化性和自我更新潜能，参与肿瘤的形成与进展。作为胚胎干细胞的特异性基因,Oct4主要表达于胚胎和生殖细胞肿瘤中,如睾丸生殖细胞瘤、精原细胞瘤、胚胎性癌和胚胎癌细胞系中。部分研究者在非生殖系统肿瘤细胞和组织,如胰腺癌Capan-2、Pan-1细胞系、肝癌Mahlava细胞系、宫颈癌HeLa细胞株、人乳腺癌MCF-7细胞系以及乳腺癌组织和膀胱癌组织中也检测到了Oct4的表达[2]。有研究发现oct4的表达与卵巢上皮性肿瘤的进展有关，从良性浆液性腺瘤进展至交界性浆液性腺癌和恶性浆液性腺癌时oct4的表达逐渐增强，并且其表达程度与肿瘤的分期有关，黏液性腺癌中的表达情况与浆液性肿瘤相似，但与肿瘤的分期没有相关性。
3.展望
近年来随着干细胞的研究越来越热，Oct4基因因此也被重视，此外Oct4在肿瘤干细胞的高表达也提示Oct4可能会成为肿瘤治疗的新靶点。我们相信随着Oct4研究的不断深入会在胚胎发育及肿瘤治疗方面取得更大进步。
[参考文献]
[1]郑鹏生,曹浩哲. Oct4基因的研究进展[J]. 西安交通大学学报(医学版),2010,05:521-526.
[2]黄灵,郜峰,张声. Oct4在肿瘤发生发展中的作用[J]. 国际病理科学与临床杂志,2013,01:78-81.
[3]Guangming Wu1 and Hans R Schouml;ler. Role of Oct4 in the early embryo development [J]. Cell Regeneration. 2014, 3:7
[4]Guilai Shi, and Ying Jin. Role of Oct4 in maintaining and regaining stem cell pluripotency [J]. Stem Cell Research and Therapy. 2010, 1.39.
开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 拟研究的问题
Oct4属转录因子POU家族成员，它在维持胚胎干细胞的增殖与分化潜能方面起关键作用。近来研究发现，Oct4在乳腺癌、肺癌等多种实体瘤中有表达，其功能可能与肿瘤干细胞紧密有关。
shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，通过RNA干扰的原理靶使基因沉默。通过设计Oct4-shRNA，构建表达载体，达到将肿瘤细胞中Oct4沉默的目的。
因此，本实验先要设计针对Oct4的shRNA，构建表达载体，最后进行功能验证，为肿瘤干细胞研究奠定基础。
二．实验目的
本实验主要通过构建针对Oct4的shRNA的表达载体，并进行功能验证，为肿瘤干细胞研究奠定基础。
三．材料和仪器：
1. 样品和标准品
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