开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
长春碱生物合成途径3个关键酶基因的克隆及其三元表达载体的构建
摘要 长春碱是长春花中重要的活性成分，能治疗多种癌症。本研究旨在利用合成生物学的研究思路和技术手段，对长春碱环烯醚萜代谢途径中三个关键酶基因进行克隆和连接，进而构建酵母表达载体，在同一个菌株中同时表达三个关键酶编码基因，为更大规模的酵母表达载体的构建奠定基础，最终实现长春花环烯醚萜代谢途径在酿酒酵母中的完全克隆。本文综述了研究背景、目的、研究方法、研究手段和实验流程。
关键词 长春碱 载体构建 基因克隆 生物合成
- 研究背景
长春花Catharanthus roseus ( L .)G . Don是夹竹桃科长春花属的一种重要药用植物, 是研究萜类吲哚生物碱代谢途径的模式药用植物[1]。它含有长春碱( vinblastine),长春新碱( vincristine), 阿吗碱 ( ajmalicine), 等 100 多种吲哚生物碱 ,多数具有活性，其中长春碱和长春新碱可用于治疗何杰金氏病 , 恶性淋巴肿瘤 , 急性淋巴细胞型白血病 , 绒毛上皮细胞癌及其它癌症 。其硫酸盐已广泛应用于临床 , 是目前应用最广泛的天然植物抗癌药物，而长春花是抗癌药物长春碱和长春新碱的唯一植物来源。由于长春花合成生物碱的产量很低，不能满足临床的需求,因此,研究长春碱生物合成途径及其相关酶和基因的表达与调控,进而利用生物工程方法对其进行大量生产,具有重要的理论和实用价值[2-4]。
长春花次生代谢能产生许多种吲哚生物碱 ，其中 6 种生物碱为细胞组织培养生产的目的生物碱 : 长春碱 、长春新碱 、阿吗碱 、蛇根碱 、长春质碱和文多灵碱 。[5] 后两者能合成长春碱和长春新碱。吲哚生物碱的生物合成有两条途径 : 莽草酸途径(吲哚途径)和甲羟戊酸途径(类萜途径)[6]。甲羟戊酸途径产生的裂环马钱子苷是合成长春碱和长春新碱的前体物质，所以可以利用合成生物学的研究方法合成长春碱和长春新碱的前体裂环马钱子苷，为通过生物合成或半生物合成生产长春碱和长春新碱奠定基础。
构建酿酒酵母多基因表达载体，能在同一个菌株中同时表达长春花三个代谢途径中关键酶编码的基因，从而合成长春碱的前体物质，最终实现长春花环烯醚萜代谢途径在酿酒酵母中的完全克隆[7-10]。快速构建酿酒酵母多基因表达载体，实现不同生物元件之间的标准化连接是亟待解决的问题[11-13]。
本课题通过对长春碱生物合成途径3个关键酶基因进行克隆，并构建其三元表达载体，从而在同一个菌株中同时表达三个代谢途径的关键酶编码基因——GES,G10H与CPR。
二．研究的目的和意义
本课题旨在利用合成生物学的研究思路和技术手段，实现长春花环烯醚萜代谢途径中三个关键酶基因的克隆和连接，进而构建酵母表达载体，在同一个菌株中同时表达三个代谢途径的关键酶编码基因。通过初步摸索三个基因的快速连接方法，为更大规模的酵母表达载体的构建奠定基础，最终实现长春花环烯醚萜代谢途径在酿酒酵母中的完全克隆。
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