DKK 家族蛋白的翻译后修饰及其功能研究文献综述

课题来源

自然科学基金与部、省、市级以上科研课题

课题性质

基础研究

课题名称

DKK 家族蛋白的翻译后修饰及其功能研究

毕业设计的内容和意义

DKK共有四种亚型：DKK1，2，3，4。目前的研究表明，DKK主要参与WNT信号通路。但最新研究表明DKK也可以独立于WNT信号通路对细胞或生物体的功能进行调控。过往的研究提示，DKK 蛋白分子存在着多种翻译后修饰的调控。因此设计实验内容：

1）纯化人293细胞（HEK293）培养基中的DKK蛋白；

2）使用SDS-PAGE方法分离DKK 蛋白；

3）通过蛋白质谱鉴定为何种修饰；

意义: DKK家族蛋白与生物体生长发育过程息息相关，其在成年人体内表达更是与骨质疏松、神经退行性疾病阿尔兹海默症以及癌症等尚未被人类攻克的疾病有着紧密关联。除去被人瞩目的WNT信号通路，作为WNT信号通路的拮抗剂DKK蛋白也可以调节其他信号级联反应，但DKK蛋白家族成员的基本分子特性和详细功能在很大程度上仍未可知。根据相关文献推测DKK家族蛋白很可能通过翻译后修饰，包括糖基化，也可能通过蛋白水解处理来修饰自身结构。但DKK功能是否仍受这些修饰的调控尚不清楚。实验表明DKK1的过表达确实能够影响失去WNT信号通路的间皮瘤细胞H28的细胞凋亡以及造成生长抑制。此外，Dkk1可以拮抗Wnt-LRP5信号传导，达到调节骨骼的生理水平的目的。而多发性骨髓瘤患者表现出强烈疼痛的骨损伤往往伴随着血清中DKK1含量升高。即可推测有尚未明确的DKK蛋白的翻译后修饰造成此现象。同时，在食管癌、乳腺癌、胆管癌、喉鳞状细胞癌、肝癌等恶性肿瘤中，患者血清或肿瘤中DKK1水平升高，且与患者总生存率下降、血管及淋巴管侵犯有关，提示DDK1有促癌作用。但也有文献报道，在结肠癌细胞系DLD-1中DKK1过表达明显抑制细胞的增殖和皮下成瘤能力，提示DKK1有抑癌作用。或许是DKK蛋白的翻译后修饰及其功能差异造成了这种不确定性。因此，研究DKK家族蛋白独立于已被熟知的WNT信号通路的生物学功能，探求DKK家族蛋白自身翻译后修饰及其功能是十分有必要的。

文

献综述

DKK家族蛋白是一种古老而保守的蛋白家族，在脊椎动物以及非脊椎动物如甲壳动物、蛇尾目动物、尾索动物和海鞘动物中广泛存在。在脊椎动物中，DKK家族由四个成员组成：Dkk1、2、3、4。它们由255-350个氨基酸组成，共享两个保守的半胱氨酸区(Crds)。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析中， HEK 293T细胞产生的人Dkk1的表观分子量约为45 kDa。DKK2，3和-4，在SDS-PAGE中观察到大量较小的分子量蛋白，这表明DKK蛋白可能含有某些二元分裂酶的靶点而进行水解，也许可作为某些蛋白酶的底物。有趣的是，对DKK蛋白的N-末端处理可能释放出包含C-末端共脂酶结构域的片段，该片段在分离时具有与全长蛋白不同的性质。但DKK功能受体内蛋白水解过程调控的可能性尚不清楚。且DKK家族蛋白结构羧基末端半胱氨酸富集区域与辅酶折叠呈现同源相似，可能意味着能发挥出类似磷脂酶、毒素、蛋白酶抑制剂和前激动素等含有该结构域蛋白相似的生物学功能。人类的Dkk1、-2和-4蛋白位于同一染色体的4/5/8/10姐妹染色体上，该基因在脊椎动物进化早期过程中完成复制，但是DKK3不同于以上。已知的DKK3的Soggy结构域与精子形成发生有关，其其他的生物活性尚未可知。WNT分泌糖蛋白家族的信号在胚胎发育时期和成年体内环境稳态中起着重要调节功能。已经证实WNT信号通路参与的调节的发育过程包括：前后轴 （AP）的轴向构图、体发生、血管生成、四肢生长发育、骨骼、牙齿和眼睛的形成以及包括癌症和骨骼疾病在内的病理内容相关。DKK代表一个进化上保守的分泌型糖蛋白小家族是WNT 信号通路中的重要拮抗分子。DKK家族蛋白能够特异性抑制WNT / beta;-catenin信号级联传导。机理为在细胞外与WNT竞争性结合LRP5/6受体抑制WNT信号通路，也可以通过诱导DKK1-LRP6-Krenen三元复合物形成，并内吞抑制WNT信号通路。实验表明，当实验鼠为DKK1基因隐性纯合子时：胚胎出现致死性、前头部结构缺失，多指并指、后融合椎体。基因型为Dkk1d/d显性纯合子时，出现多指后合趾。基因型为Dkk2隐性纯合子导致活体可育骨量减少、致盲、角膜变形。基因型为Dkk3隐形纯合子活体肺通气减少和红细胞压积升高。证明了DKK蛋白在小鼠胚胎形成及生长发育过程中的决定性作用。

研究内容

1. 培养稳定表达人源DKK3 的293细胞株。并设立对照组、空白对照组。
2. WB实验检测 DKK蛋白的表达水平。提取培育后各组细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将蛋白转至NC膜， 5%脱脂奶封闭，选用合适物种的单克隆抗DKK抗体为一抗（1∶1 000）、合适物种的抗体为二抗（1∶2 000）进行WB实验，分析比较空白对照组、对照组、DKK蛋白的相对表达水平。
3. 流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡情况。
4. 统计学处理WB、流式细胞术等实验均重复3 次。采用软件进行统计数据分析，绘制图片。计量数据以xplusmn;s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以Plt;0.05或Plt;0.01表示差异有统计学意义。
5. 收集细胞培养基并采用免疫免疫沉淀法纯化DKK3蛋白。
6. SDS-PAGE 分离DKK3蛋白，并用银染法标记出胶中的目的蛋白。
7. 切割DKK3蛋白，送蛋白质谱鉴定出哪些翻译后的修饰。

研究计划

1-3周查阅相关文献、确定实验流程、整理实验中可能存在的问题并寻找解决方案

4-8周进行试验、处理实验数据并撰写论文。

9-10周论文修改定稿。

参考文献

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Cristina-Maria Cruciat1and Christof Niehrs1,2

1Division of Molecular Embryology , DKFZ-ZMBH Alliance, DKFZ, Im Neuenheimer Feld 280, D-69120

Heidelberg, Germany

2Institute of Molecular Biology , D-55128 Mainz, Germany

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