- 研究背景和立题依据：
A型轮状病毒是人类婴幼儿腹泻的主要原因.全球每年约有60万人因轮状病毒感染而死亡。轮状病毒感染肠道后，在其中进行增殖复制，导致急性肠胃炎和病毒性腹泻，严重感染者最终因脱水和电解质流失而死亡。使用轮状病毒疫苗是有效预防轮状病毒性腹泻的有效手段。目前世界范围内已经有轮状病毒疫苗上市，默克公司、葛兰素史克公司、中国生物技术集团公司兰州生物制品研究所等都有研发上市的轮状病毒疫苗，并在预防和治疗轮状病毒引起的腹泻上取到了显著的效果。但轮状病毒疫苗的应用只在发达国家比较普遍，美国甚至将轮状病毒疫苗纳入了免疫计划；在发展中国家或者一些欠发达的地区，由于轮状病毒疫苗高昂的价格，疫苗接种覆盖率并不高。此外，轮状病毒具有区域性，对于不同地域的毒株，在不同环境或培养条件下培养，对人体产生的免疫效果都不一致。通常的表现为:同一疫苗,在经济发达区域,保护效果较好,但在亚非等欠发达区域,保护效果通常只有30%-40%。针对这一问题，必须在轮状病毒腹泻流行的地域筛选理想的毒株。减毒活疫苗通常是通过一定的方法将野毒株进行处理,使其对宿主的致病力减弱或消失,但保留刺激机体产生免疫原性和保护力而获得的。偶尔自然界也存在天然减毒株。由于减毒活疫苗保持了抗原性，当其接种到人体之后，能刺激机体产生特异性免免疫反应，以达到长期保护作用。
Vero细胞是WHO指定的生产人用疫苗的细胞基质，它对多种病毒敏感。本课题选取vero细胞为病毒培养的细胞基质，采用CDC-9 3p4e-1毒株，将使用VP、MEM、DMEM三种培养基进行对照试验，筛选最合适病毒生长的培养基种类。此后，将分别使用猪胰酶和基因工程胰酶为病毒活化剂，对比不同量的此两种胰酶的使用效果并筛选出最佳使用量。
- 具体实验内容
- vero细胞培养、计数
查阅文献获知vero细胞培养的最佳方式，将vero细胞连续传代培养，获得每一阶段实验所需要的vero细胞。每次传代后进行细胞计数，统计分析每个T175瓶中细胞数量。Vero细胞传代后第48小时更换培养液，第72小时接种病毒。
- 培养基类型筛选
取某一代vero细胞按一定的MOI接种轮状病毒后，控制培养液pH、温度、胰酶种类及含量等培养参数，分别使用等量的VP培养基、MEM培养基、DMEM培养基作为维持液对CDC-9进行培养，观察各种培养条件下（细胞病变能力（病变快慢）和病毒滴度（大小））（病毒的增殖情况），选取最合适轮状病毒株生长的培养基类型。轮状病毒接种量由公式MOI（病毒最佳感染复数）=(virus/cell)=0.1计算。通过预实验进行细胞计数得知，在现行培养条件下，每个T175瓶中细胞数量约为4000~6000万。
- 胰酶种类筛选
在选定了最适培养基种类之后，控制培养基种类、pH、温度等参数，分析不同种类和浓度的胰酶对病毒增殖的影响。在该轮实验中接毒时，设置对照试验，分别加入一定浓度梯度的猪胰酶或基因工程胰酶（如2ug/ml，4ug/ml,6ug/ml,8ug/ml），先探索两种胰酶的大概使用区间。
- 胰酶使用量分析
确定了两种胰酶的大概使用区间后，精确划分胰酶的使用量，减小各预设参数之间的差距，通过对比细胞病变程度和收获物病毒滴度，确定两种胰酶的最适使用量。
- 参考文献
- 一株人源性轮状病毒的分离及其在vero细胞上的适应性培养；李松
- 中国轮状病毒疫苗发展前景；杜加量
- 口服轮状病毒活疫苗的研究及临床应用进展；王宏，段招军
- Vero细胞作为基质的病毒性疫苗研制进展；吴浩飞
- 轮状病毒P【2】G3株和P【8】G1株对vero细胞的适应性培养及灭活研究；张永欣
- WHO关于轮状病毒疫苗的意见书
以上是毕业论文文献综述，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
