一、课题研究背景
细胞内定向运输是细胞基本生命活动，负责细胞内物质的传递、交换和循环使用。细胞内定向运输一般依赖细胞骨架，主要分为微管和微丝两大类。其中，分布在细胞中央的主要是微管，微丝则主要聚集在细胞边缘而与细胞外膜接近。真核细胞中的长距离运输由沿着微管轨道运动的分子马达所牵引，分子马达是一类将细胞骨架与所运输货物相连接，同时为定向运输提供动力能源的蛋白质分子，主要负责细胞内的物质运输、细胞极性的产生以及整个细胞的运动等重要生理过程。分子马达因为作用于不同的细胞骨架而分为不同的超家族：依赖于微丝的肌球蛋白（myosin）以及依赖于微管的驱动蛋白（kinesin）和动力蛋白（dynein）。在神经细胞等一些高度分化的细胞中，微管的极性尤为明显，其从细胞体投射至轴突末梢，负极端位于细胞体，正极端位于细胞边缘。驱动蛋白主要负责由负极端向正极端（胞体向轴突末梢）的货物运输，包括神经递质囊泡前体、线粒体、mRNA复合体等，与之相对应，动力蛋白主要负责由正极端向负极端（轴突末梢向胞体）的逆向运输，如神经生长因子等。驱动蛋白马达是一种酶，能够将ATP水解的化学能转变为沿着微管轨道运动的机械能。驱动蛋白在微管上延续性快速的运动是细胞内精确高效的物质运输的前提保障，驱动蛋白的功能紊乱与很多神经退行性疾病相关联，如帕金森式综合征(PD)、阿兹海默综合征(AD)，肌萎缩侧索硬化（ALS）等。我们对驱动蛋白的了解大多来源于对驱动蛋白超家族的基础成员驱动蛋白-1（KIF5）的研究。最小的驱动蛋白-1只包含马达结构域和负责二聚化的序列，能够以8nm的步长（相邻beta;-微管蛋白亚单位之间的距离）向微管正极端连续运动（许多轮催化反应保持与微管的结合），产生0.6-0.8m每秒的速度，连续性是由于交替步进机制，两个马达结构域尽然有序交替进行催化循环，并始终，保持马达-微管的相互作用。目前，对驱动蛋白马达结构域的生化和生物物理特性已有广泛研究，但在复杂的细胞环境中马达是如何工作却知之甚少。虽然各微管上运动的驱动蛋白家族的马达结构域高度保守且功能机制相似，但它们的活性调节机制却有很大的不同。之前的研究表明，驱动蛋白-3家族的二聚化对其活性调节起着重要的作用，对其在微管上的延续性运动起着同样重要的调控作用。在研究较多的驱动蛋白-3家族KIF1A中，FHA-CC1的自折叠和二体的平衡是调控的中心。考虑到驱动蛋白-3家族的KIF16B和KIF1A序列的家族内差异，其是否采取与KIF1A相同的二聚化机制或采取其他机制却尚不清楚。因此，本课题将致力于研究KIF16B的活性调节机制。
二、课题研究内容
驱动蛋白KIF16B的快速运动需要二聚体的形成，以及在体内可以检测到二聚体的存在，都一致暗示了KIF16B应该也是以二聚体形式进行货物运输。在本课题研究中，我们将主要对KIF16B的二聚化问题进行研究，对其形成二聚体的二聚化机制进行研究。驱动蛋白KIF16B马达动力结构域后面的非传统调控区，是作为区别于传统驱动蛋白的关键部分。经过初步研究，我们现已发现通过串联非传统调控区域能够形成稳定的二聚体，意味着这段区域能够直接介导KIF16B二聚体的形成。在本课题研究中，我们将进一步利用结构生物学手段研究KIF16B二聚体的三维空间结构，揭示KIF16B二聚体形成的机制。因此，通过本课题研究，将会进一步揭示驱动蛋白KIF16B二聚化的全新运动模式，为全面认识神经细胞内基于驱动蛋白的定向运输规律提供进一步的理论基础。
尽管体内研究已发现驱动蛋白KIF16B可以形成二聚体，但二聚体形成的分子机制目前尚不清楚。综上所述，本课题研究内容就是为解决这一重要科学问题而展开，主要拟展开对驱动蛋白KIF16B中部分结构域进行结构与功能的研究。
1）KIF16B 非传统调控区域的生化性质研究
根据KIF16B结构域的分布情况，和传统驱动蛋白相比有一个非传统调控区域，主要由CC1-FHA-CC2结构域组成。我们首先对这一区域内的结构域进行生化性质研究，主要通过表达和纯化各个不同的结构域，进行生物物理和生物化学方法的表征，从而可以找到负责KIF16B二聚化的结构域片段。
2）KIF16B二聚体的结构研究
上述研究结果表明，KIF16B分子马达结构域后面非传统调控区域中的CC1-FHA可以形成二聚体，从而KIF16B二聚体的形成方式也许和传统驱动蛋白相类似，主要利用分子马达结构域后面的区域来负责。通过以上生化性质的研究指导我们进一步以X射线晶体学、核磁共振等研究手段对KIF16B二聚状态的结构生物学研究。通过上述研究，从而可以揭示KIF16B二聚体形成的具体机制。
三、主要技术方法
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