开题报告内容：
- 课题背景
Grp94/gp96（葡萄糖调节蛋白94），又称内质网蛋白99，是一种主要位于内质网中的分子伴侣蛋白，也是内质网腔中最为丰富的蛋白质。普遍存在真核细胞中，可以水解ATP,并能够通过与钙形成复合物，引发多种细胞免疫应答，参与内质网到应激反应，是内质网应激反应中的重要因子。因此，Grp94被认为在内质网蛋白质的质量控制中发挥了关键作用。
Grp94的结构已被报道，Grp94 由位于 12 号染色体上的基因编码，由 803 个氨基酸构成，结构上可以分为以下三部分：N端结构域、中间端结构域、C端结构域三部分，其中N端的信号肽和 C 端的一个四肽结构 KDEL 负责蛋白在内质网的定位。绝大多数 Grp94 分布于内质网腔中，一部分 Grp94 也可以定位于细胞的表面，可能与其 C端 KDEL 四肽的缺失有关。在含有 ATP 类似物的环境中，Grp94的二聚体通过空间变换形成“V”字形使 ATP 结合区域变形，X 线衍射研究发现当 Grp94 中的某一段区域发生 90 度旋转时，它将具有催化活性，由此推测这种变化可能是调节 Grp94 功能的关键步骤。Grp94 糖基化的过程受其表达情况的影响而发生变化，Grp94 在正常情况下只对氨基酸的两个位点进行糖基化，但当 Grp94高表达时它的羧基端也可以进行糖基化 ，从而引发过度糖基化。这种作用机理较为复杂，可能与肿瘤的产生、增长及细胞免疫相关。
- 研究的目的和意义
Grp94作为Hsp90（热休克蛋白90）家族的一部分，与HSP90的旁系同源物相比具有50%的同源性。同其它HSP一样，由错误折叠蛋白质的积累诱导表达。Grp94已被证明是TLRs，整合素，Wnt共同受体，低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）等客户蛋白必需的分子伴侣。研究表明Grp94是早期B淋巴细胞和T淋巴细胞生成所必需的，在巨噬细胞的先天免疫防御功能和调节性T细胞的免疫抑制功能密切相关。
临床上，Grp94的表达与多种癌症的晚期和不良生存相关。最近的临床前研究还表明，Grp94的表达与恶性肿瘤，卵巢癌，多发性骨髓瘤，肺癌和炎症相关结肠癌的癌症生长和转移密切相关。 Grp94可通过整合蛋白，Wnt共同受体和其他关键途径的组分的折叠来促进癌细胞内在发生的肿瘤发生，而Grp94还可以通过调控TLRs、TGF-beta;的激活，促进免疫抑制细胞的活化。因此，Grp94可作为一种关键的分子-连接蛋白对压力和炎症进行控制，是癌症治疗的一个具有吸引力靶点。
- 现有抑制剂
图1：现有抑制剂结构
目前已开发出几种Grp94选择性抑制剂，并且在体外研究期间已显示出针对多种癌细胞类型的抗增殖和抗迁移活性，在结构上可分为嘌呤类（代表PU-H54，PU-WS13）、间苯二酚类（Bnlm、KUNG94、KUNG29）及苯甲酰胺类(ACO1)。然而，现有的Grp94抑制剂几乎不能同时表现出对Grp94良好的选择性亲和力，这限制了对Grp94细胞功能的进一步研究。嘌呤类抑制剂PU-WS13仅对Grp94具有高亚微摩尔亲和力，并且仍然表现出对Hsp90alpha;的弱抑制作用；间苯二酚类的Grp94抑制剂如Bnlm和KUNG29表现出低选择性和亲和力；KUNG94虽然表现出对Grp94的低纳摩尔亲和力，但是选择性差，难以区分Grp94抑制和Hsp90抑制的引起的生物学效应；苯甲酰胺类抑制剂ACO1具有良好的选择性，但对Grp94仅具有中等亲和力。
- 拟解决问题
为了发现新的Grp94选择性抑制剂，我们分析了具有Grp94选择抑制作用的化合物2：Hsp90alpha;和Grp94的共晶体结构。。当与Hsp90alpha;结合时，化合物2采用“向前弯曲”构象，8-芳基插入位点1疏水口袋，Phe138残基采用“平面”构象。当与Grp94结合时，化合物2采用“向后弯曲”构象，8-芳基基团进入新暴露的位点2疏水口袋，Phe199残基（相当于Hsp90alpha;中的Phe138）采用“倾斜”构象。相反，在Apo-Grp94 ATP结合口袋中，Phe199采用与Hsp90alpha;复合物中的Phe138相同的“平面”构象。晶体结构的叠加研究清楚地表明，与Apo-Grp94中的Phe 199相比，2：Grp94复合物中的Phe199在一定程度上发生了位移。该配体诱导的“Phe199移位”效应导致Grp94的构象变化和Grp94特异性位点2疏水口袋的暴露。在这些分析的基础上，我们得出结论，配体诱导的“Phe199移位”效应是Grp94选择性抑制的结构基础。
当前已设计出多种结构类型的Hsp90抑制剂，但仍存在两个重大挑战。首先，目前正在临床试验中的Hsp90抑制剂对Hsp90四种亚型具有相似的亲和力，这些“泛-Hsp90”抑制剂在抑制任何Hsp90旁系同源物的生物学作用方面的用途有限。如果可以开发针对单个旁系同源物的抑制剂，对每个亚型在细胞中的作用将会显着提高。其次，现有的泛Hsp90抑制剂在临床研究中观察到严重的不良毒副作用，并会出现补偿性伴侣通路如Hsp70的上调。基于以上问题，Grp94亚型选择抑制剂作用的客户蛋白较少，可能具有更好的安全性。因此我们可以设计高选择性Grp94靶向抑制剂用于特定疾病的治疗。
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