一丶课题背景
凝血酶（Thrombin），是从牛血或猪血中提取经激活而得的一种速效的局部止血药，直接作用于血液凝固过程的最后一步，促使血浆中的可溶性纤维蛋白原转变成不溶的纤维蛋白，达到止血的目的，pHlt;5 时失效，而且凝血酶还能促进上皮细胞的有丝分裂，加速创伤愈合，是一种速效的局部止血药，用于外伤、手术、口腔、耳、鼻、喉、泌尿、烧伤、骨科、神经外科、眼科、妇产科以及消化道等部位出血的止血。
- 要解决的问题
凝血 凝血酶作为一种体内必不可缺的一种蛋白，蛋白多肽类药物作为一种大分子化合物，其基本骨架为氨基酸序列，与内源性蛋生物大分子的结构组成相似，采用传统的样品前处理方法难以有效地将其从复从复杂的生物基质中分离、提取和纯化。由于凝血酶极高的生物活性，作为药用是剂量很少，在体内较难检测，需要采用较高的灵敏度的检测方法与手段。LC-MS法对于一般小分子药物具有超高的灵敏度，但是大分子多肽若采用质谱检测时离子化效率底，质谱检测灵敏度低，在此次实验中能够，需要解决凝血酶的富集，凝血酶与质谱标签小分子之间的定量对应关系及LC/MS分析蛋白质响应低的问题。综上，目前建立灵敏专属的检测基质复杂的生物样品中蛋白类药物的分析方法面临的主要问题主要表现为：（1）蛋白类药物和内源性蛋白多肽均由氨基酸组成，结构性质相似，将蛋白类药物从复杂的生物基质中分离纯化；（2）蛋白类药物所需给药剂量小，从而体内浓度低，同时各种内源性蛋白多肽含量要高于药物成千上万倍，使得难以实现蛋白多药物的灵敏、准确分析测定。因而，为满足低浓度或超低浓度待测蛋白类药物的分的要求，提高分析方法的灵敏度和度和专属性迫在眉睫，其中如何将检测信号放大是目前高分析方法灵敏度的一大研究热点。
- 可行性分析
液相色谱-质谱（LC-MS）以LC为分离手段，MS为检测手段，集LC的高分分离能力与MS的高灵敏度、高专属性于一体，已成为药物杂质检查、体内药物代谢、代谢产物的药物代谢动力学研究和结构研究等现代药学前沿领域中最强有力的分析工具之一。随着功能化纳米材料的不断发展，特异性选择功能化材料在药物分析领域中得到了广泛关注，通过特异性选择功能化材料成功实现了各种样品中待测物质的有效分离富集及检测。随着人们对纳米新材料的合成与性能研究的深入，将有更多性质独特的介质应用于样品前处理领域，为样品前处理技术的发展带来新的机遇。进一步发展新型的特异性选择功能化材料以提高其选择性、吸附能力，降低背景干扰并提高萃取效率，使其在复杂样品前处理及信号放大等应用领域中发挥更大作用。
- 研究方法和内容
- 查阅文献，熟悉掌握凝血酶的结构及其理化性质。
- 为了实现待测蛋白类药物检测信号最大限度的放大和更快速的构建功能化纳米复合物，需考察优化在最短时间内达到纳米粒子单位表面引入最大量的凝血酶的目的条件。因而，有必要进行纳米粒子对凝血酶的吸附静力学及动力学的研究。
- 适配体捕获凝血酶条件的优化
- 释放标签小分子的优化 pH 对标签分子释放的考察
- 建立方案，标签小分子的选取，建立和优化LC-MS分析人体三明治结构凝血酶的色谱条件与质谱条件
建立和优化方法时采用的实验步骤概括如下：
- Q1扫描确定母离子的质荷比 根据质谱小分子标签标记的凝血酶的性质，选择分析的极性（ 或-）、离子化方式（ESI或APCI），根据分子量选择扫面范围和时间，确定母离子的质荷比。
- 子离子扫描确定子离子的质荷比 获得高质量的二级质谱图，以母离子的强度为MS图谱中峰强度的1/3到1/4为宜，平滑后选择子离子质荷比。
- 优化凝血酶相关参数 根据前面选出的母、子离子，组建MRM离子对；选择多个离子对时，应合理分配每一对的分析时间；用“Ramp”，优化Compound项下各参数，以及Source项下CAD参数。各离子对应分别设定；初步建立MRM方法；一般优化两次，已得到比较准确的结果。
- 优化离子源参数。
- 优化色谱条件 接色谱柱，用适当浓度样品考察分离情况，MRM方式可以不必所有峰都基线分离，但要注意避开介质离子抑制的干扰；调整色谱流动相组成和流速，并相应调整源参数。
5.应用优化后的方法对人体血浆样品进行测定。
- 工作计划
3月1日—3月30日：完成文献查阅、开题报告等前期工作。
4月1日—5月10日：完成实验。
5月11日—5月20日：完成毕业论文的撰写工作。
5月21日—5月30日：完成毕业论文的评阅与修改工作。
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