课题：藏红花酸诱导结肠癌细胞HCT116凋亡的机制研究
结肠癌是临床上常见的恶性消化系统肿瘤,死亡率仅次于肺癌和肝癌。目前结肠癌的发病率呈逐年升高的趋势'，每年超过3000万人被诊断为结肠癌2。外科手术切除病变组织是目前结肠癌治疗的主要手段,但多数患者确诊时已发展为中晚期，患者经手术治疗后复发率较高。近年来随着对结肠癌发病原因的深人研究及靶向治疗药物的应用,结肠癌的临床疗效已有很大改善,但总体疗效及预后仍不理想。中医药是抗肿瘤治疗的重要组成，并具有独特的临床优势，受到临床关注。传统中药及其有效单体成分是抗肿瘤药物的重要米源之一，如喜树碱及其衍生物等早已用于临床治疗结肠癌。
藏红花酸又称番红花酸，其化学式为C20H24O4，是一种在藏红花、栀子花中共存的一类自然界中少有的水溶性类胡萝卜素。今年来的研究发现，藏红花酸是珍贵的药用资源，具有预防心血管疾病和阿尔茨海默病、减少皮肤损伤、抗抑郁、保护肝脏、抗肿瘤等作用【1】.其中，藏红花酸抗肿瘤作用机制尚未明确，诱导细胞凋亡、阻止细胞周期进程、以制基质金属蛋白酶的表达、调节部分II期解毒酶和降低炎症分子的表达是藏红花诱导抗肿瘤作用的潜在机制【2】。
细胞死亡有两种方式 ,一种是在一些损伤因素作用下细胞不能保持离子平衡而被动发生的非特异性 的变化和结构的改变 ,称为细胞坏死;另一种是细胞 在接受某种信号或受到某种因素刺激后的一种主动 的由基因控制的有序的死亡过程 ,称为细胞程序性死 亡 (p rogrammed cell death , PCD) ,也即细胞凋亡 (Ap2 op tosis)。细胞凋亡具有积极的意义 ,它既是机体组织 和器官发生、发育的维护者 ,又是机体防御致病因素 的防御者。引起细胞凋亡的因素很多 ,主要有两种 : 一种是机体生长发育的需要 ,如细胞凋亡与分裂相互 协调共同控制胚胎发育、器官分化及退化、造血等生 理过程;一种是除去危害细胞如感染病毒细胞、DNA 损伤细胞、免疫系统细胞和癌细胞等。凋亡机制的异 常会使细胞无限的增殖 ,导致肿瘤的发生或抗肿瘤治 疗的失败 [ 1 ]。肿瘤的发生发展是一个极其复杂的过 程 ,不仅是细胞的增殖失控的结果 ,也是细胞凋亡受 阻的结果。细胞的增殖与凋亡是一个双向调节的过程 ,受很多因素的影响。
细胞凋亡通路主要有死亡受体（Fas）通路、线粒体通路、细胞毒性T细胞诱导凋亡、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路、内质网通路、p53通路等【3】。根据目前的研究表面SIRT1通过对转录因子p53、FOXO家族、Ku70、NF-kB等因子的催化去乙酰化调控参与细胞凋亡。本次课题以SIRT1与AMPK mRNA表达的影响来探究藏红花酸诱导细胞凋亡的机制。
本次课题以结肠癌细胞HCT166为例，探究藏红花酸对其凋亡的影响及其作用机制。
方法：
1.细胞培养用DMEM培养液培养HCT-116细胞,培养条件为5%CO2.37℃,48h后收集处于对数生长期、生长良好的HCT-116细胞，细胞浓度为1X109个/升。孵育24h后弃去上清液，设A组为对照组,B、C、D组为实验组，四组分别加人0、2、4、8mu;g/mL的藏红花酸处理，其中DMSO终浓度lt;gt;。2.采用MTT法检测细胞增殖按6X103个/孔在96孔板中种植HCT-116细胞，A、B、C、D组细胞分别处理24、48、72h后，加人20mu;L0.5mg/mL MTT溶液，继续培养6h。培养完成后.振荡8min,于450nm波长处用酶标仪检测吸光度值(A值),计算细胞增殖抑制率=(1-实验组A值/对照组A)100%。
3.碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡A、B、C、D组细胞处理24h后，用不含EDTA的胰酶收集细胞,PBS清洗2次，收集1X105个细胞并重悬，加入10mu;LPI.使用流式细胞仪测出各组细胞的凋亡率。细胞凋亡率=(右上象限细胞数 右下象限细胞数)/细胞总数X100%。
4.采用RT-PCR检测细胞SIRT1、AMPK mRNA的表达A、B、C、D组细胞分别处理24、48、72h后收集细胞.使用Trizol法提取总RNA。以beta;- actin作为内标，采用RTPCR检测各组细胞中SIRT1、AMPKmRNA的表达。使用引物见表1.上述实验均重复5次。
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