应用MALDI质谱成像技术研究黄芩中次生代谢产物的组织分布特征文献综述

主要研究内容、预期成果（鼓励有创新点）：

黄芩(Scutellaria Radix)，别名黄金茶、山茶根、烂心草，以粗长、质坚实、色黄、除尽外皮者为佳。在出土的《五十二病方》中已有应用记载，《神农本草经》将其列为中品。我国黄芩属植物有余种，多为野生，南北均产。但入药黄芩主要有以下几个种:黄芩（S.baicalensis Georgi）,滇黄芩（S.amoena C）,粘毛黄芩（S.viscidula Bge）,丽江黄芩（S.likiangensis Diels）,川黄芩（S.hypericif olia Levl），大黄芩（S.tenax W），薄叶黄芩（S.ilonnikovii Juz），甘肃黄芩（S.rhderiana Diels），但《中国药典》中只以唇形科多年生草本植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根为正品。黄芩性寒、味苦;归肺、心、肝、大肠经，能清热燥湿、泻火解毒、凉血止血、安胎；用来泡茶喝有清凉败火、消炎去暑的功效，是清热燥湿的常用药之一，现临床常用于肺热咳嗽、高血压、上呼吸道感染、肺炎、胎动不安、湿热黄疸、咳血、目赤、痢疾等症。黄芩中含有多种类型的化合物，如黄酮类、挥发油类、萜类、多糖等，经现代研究表明，黄芩中黄酮类化合物为其主要有效成分，其中含量较高的有黄芩苷(baicalin)、汉黄芩苷(wogonoside)、黄芩素(baicalein)、汉黄芩素(wogonin)和千层纸素A(oroxylin A)等。黄芩主要的药理作用有解热、抗炎、抗菌、抗病毒、对消化系统作用、抗肿瘤等，主要化学成分还有清除自由基、免疫调节等作用。通过查阅和调研大量文献发现，目前国内外学者针对黄芩的化学成分和药理药效进行了大量研究，而关于探究黄芩的次生代谢产物组织分布的研究较少，故而本课题将以黄芩中黄酮类次生代谢产物为主，采用质谱成像技术探究其在组织内的空间分布特征。

质谱成像(mass spectrometry imaging，MSI)是一种新型的成像技术，它将质谱的离子扫描过程与专业图像处理软件结合，对样本表面分子或离子的化学组成、相对丰度及空间分布情况进行全面、快速分析。其基本原理为:利用激光束照射涂覆有基质的组织切片，使其表面分子解吸/离子化, 然后通过质谱仪检测离子的质荷比(ratio of mass to charge, m/z),再由成像软件将测得的质谱数据转化成相应像素点，重构出目标化合物在组织表面的空间分布图像,该技术具有快速、灵敏及准确的特性。

近年来,随着MSI技术的不断发展与完善,质谱成像正逐渐成为质谱分析领域的研究前沿与热点。目前,该技术已被广泛应用于诸多领域:如基础医学、药学、微生物学、动物学等。迄今为止，随着质谱技术的发展与新型离子源的陆续开发,科学家已构建了多种质谱成像的方法，主要有基质辅助激光解吸电离质谱成像(matrix assisted laser desorption ionization massspectrometry imaging, MALDI-MSI)、解吸电喷雾离子化质谱成像(desorption electrospray ionization mass spec-trometry imaging, DESI-MSI),以及二次离子质谱成像(secondary ion mass spectrometry imaging, SIMS imaging)等等。

MALDI-MSI是目前发展较为成熟的成像技术，该技术无需复杂样本前处理,通过基质辅助实现待测分子的离子化,离子化过程中产生较少的离子碎片,可实现对较宽质量范围内的多种化合物分子的快速分析,空间分辨率可达10mu;m,灵敏度高达fmol级。目前MALDI-MSI普遍适用于生物组织表面蛋白质、多肽、脂类、能量代谢产物等多种生物分子原位成像表征。MALDI-MSI技术基本流程如下:首先根据植物性质选择是否包埋，再在minus;20℃条件下使用冷冻切片机内进行组织切片的制备,然后选择合适的化学基质,在特定基质喷涂技术的辅助下将基质喷涂于组织切片表面,之后使用激光直接照射扫描切片,由于基质与组织切片表面分子形成共结晶,因此基质吸收的能量可有效传递给待测分子并实现其离子化,离子化分子在电场或负压的作用下进入质谱源后部分,经质量分析器分析后被质谱检测器检测并记录,最后通过特定软件重构呈现待测分子在组织表面的空间分布图像。常用质量分析器有:飞行时间(time-of-flight, TOF)、离子阱(ion trap, IT)、四级杆(quadrupole)、静电场轨道阱(orbitrap)、傅里叶变换离子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance, FT-ICR)等。不同质量分析器具有不同的特点,其适用检测对象也不尽相同,例如,高灵敏性TOF对于生物大分子表征(如蛋白质、多肽、多糖)具有较强适用性,而高分辨率FT-ICR则对于小分子化合物具有明显偏好性。在MALDI-MSI分析中,图像质量很大程度上取决于基质体系的建立及优化,因此基质的选择与喷涂至关重要。采用不同的基质，MALDI-MSI可实现对小分子药物到生物大分子的原位分析，经典的MALDI-MSI基质，主要有芥子酸(sinapic acid, SA)、alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸(alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA)、2,5-二羟基苯乙酮(2,5-dihydroxyacetophenone, DHAP)、2,5-二羟基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid, DHB)、9-氨基吖啶(9-aminoacridine, 9-AA)、2-巯基苯并噻唑(2-mercaptobenzothiazole, 2-MBT)、1,5-二氨基萘(1,5-diaminonaphthalene, DAN)等。其中SA, DHAP适用于高分子质量生物分子检测,如蛋白质、糖蛋白、低聚糖等;而CHCA,2-MBT通常适用于检测中等分子量分析物,如多肽、脂类分子等;DHB,DAN和9-AA则适用于检测低分子量的脂类分子、能量代谢产物等。

利用MALDI-MSI技术对药用植物活性成分成像表征已逐渐成为质谱领域的研究新趋势之一。与传统成像方法相比，该技术在药用植物研究方面凸显优势。一方面，MALDI-MSI技术能同时提供样本表面多种分子组成、丰度及空间分布信息。另一方面，该技术具有较高的检测灵敏度及较强的分子鉴定能力,对于植物组织中多种低丰度蛋白质、多肽、微量元素、内源性小分子代谢物等具有较高的适用性。该技术已用于多种药用植物的有效成分原位分析,如叶下珠、甘草、鬼臼、火棘、红果樫木、人参、白芍等。

综上所述，本研究将建立MALDI-MSI方法检测黄芩中的黄酮类成分，并对化合物的空间分布特征进行研究，主要从样本的制备过程和MALDI基质的选择进行优化，从而实现黄芩内源性分子的原位表征。

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