阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），又叫老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。AD的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为beta;淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。 Tau蛋白概念 微管系统是神经细胞骨架成分，可参与多种细胞功能。微管由微管蛋白及微管相关蛋白组成，Tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白。正常脑中Tau蛋白的细胞功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管；与形成的微管结合，维持微管稳定性降低，微管蛋白分子的解离，并诱导微管成束。Tau蛋白基因位于17染色体长臂。正常人中由于Tau蛋白mRNA剪辑方式不同，可表达出6种同功异构体。Tau蛋白为含磷酸基蛋白，正常成熟脑中Tau蛋白分子含2～3个磷酸基。而阿尔茨海默症（老年痴呆症）患者脑的Tau蛋白则异常过度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5～9个磷酸基，并丧失正常生物功能。 Tau蛋白与AD AD(Alzhemier Disease)是德国医生阿尔茨海默最先发现的一种脑神经疾病。它的主要症状有两个：一是 beta;-淀粉样蛋白在神经元细胞外异常沉积形成的老年斑，二是tau蛋白的异常磷酸化所形成的THFs。最近有研究表明相比beta;-淀粉样蛋白的异常沉积，tau蛋白的异常磷酸化所导致的聚集同AD的相关性更高。AD患者脑中存在大量异常Tau蛋白。Tau蛋白异常修饰、含量变化对临床AD病理发生有重要作用。 血浆、脑脊液Tau蛋白水平分析 AD患者血浆、脑脊液（CSF）中Tau蛋白测定可用酶联免疫吸附法（ELISA），研究表明AD患者CSF中Tau蛋白水平比同龄正常及非神经疾病患者组均显著增高。用CSF中Tau蛋白含量增高诊断AD，其敏感性为82%，特异性达70%。如同时测出CSF中Tau蛋白水平增加及beta;-AP42水平降低，对AD诊断的特异性可达70%～90%。 抑制Tau蛋白特异修饰作用 由于Tau蛋白的异常修饰涉及多种酶，可在此基础上发展新的治疗AD药物。应用磷酸酯酶及该酶激活剂类药物，降低Tau蛋白磷酸化过程，可能对AD患者的神经元纤维退化有抑制甚至逆转的作用。也可考虑用分解糖基的特异糖苷酶，限制Tau蛋白的异常糖基化。 |
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beta;-分泌酶 大量的实验研究提示beta;-淀粉样蛋白（Abeta;）在阿尔茨海默病（AD）的发病机理中起重要作用。老年斑（SP）是AD的两大病理改变之一，主要是由Abeta;在脑中逐渐沉积所致。Abeta;来源于I型跨膜蛋白淀粉样前体蛋白（APP）。目前已知有三种分泌酶参与APP的分解代谢，其中beta;分泌酶和gamma;分泌酶主要参与了Abeta;的生成。近来研究发现，AD患者脑中beta;分泌酶的表达和活性明显增高。现在，这些蛋白酶的特性研究取得一定进展:beta;分泌酶本质上是一种新型跨膜天冬氨酸蛋白酶、APPbeta;位点剪切酶1（BACE1，也称为Asp2或memapsin2）。BACE1具有beta;-分泌酶所有已知的功能性质和特征，是Abeta;起始生成的关键酶，是AD治疗中具有希望的药物作用靶点。BACE2是与BACE1同源的天冬氨酸蛋白酶，具有一定的beta;分泌酶活性，同时又具有选择性alpha;分泌酶功能。 在APP的分解代谢中，beta;分泌酶参与了Abeta;的生成。在散发性AD患者中，Abeta;生成增加与beta;分泌酶表达和活性增高有关 ［4］ ，而某些类型FAD的发生亦与beta;分泌酶有密切关联。目前已经积累了大量关于组织和细胞中beta;分泌酶主要特征的资料，而这些资料将是确认某种具体beta;分泌酶所必须的。
beta;分泌酶在机体的多种组织和细胞中都有表达，但在神经组织和神经元中活性最高，而在星型胶质细胞中较少表达。细胞中，beta;分泌酶只能有效裂解与膜结合的APP底物，而在转染细胞中，缺乏跨膜结构的APP并不会被beta;分泌酶裂解。这提示beta;分泌酶可能是一种膜结合蛋白，或者是一与膜蛋白密切联系的蛋白。同时，研究表明beta;分泌酶在酸性亚细胞器中活性最高，如果细胞内pH遭破坏，beta;分泌酶的活性亦被抑制，所以beta;分泌酶的活性位点位于酸性细胞器内腔之中，包括高尔基体和内质网。 beta;分泌酶要求APP的beta;位点氨基酸序列具有很高精确性，如Met-1→Leu（瑞典FAD突变）将上调beta;分泌酶的活性;相反，Met-1→Val将抑制beta;分泌酶的剪切作用，而该位点和周围位点其他突变都会降低beta;分泌酶的活性。 研究发现，细胞外SP中的Abeta;主要始于内质网Abeta;Asp 1处切割APP，最终产生Abeta;1-40/42，同时beta;分泌酶在Glu 11有平行的切割作用，切割产物与Asp 1相类似（Abeta;11-40/42），但主要在反面高尔基网状结构（TGN）中完成 ［16］ 。此外，beta;分泌酶的活性并不受抑肽素的抑制，后者是许多天冬氨酸蛋白酶的抑制剂。 二、研究内容和方法 （1）整体动物治疗效果评价：使用脑立体定位仪对小鼠注射Abeta;，建立小鼠AD模型，通过给予治疗AD的阳性药和MT（褪黑素）受体阳性激动剂，采用水迷宫实验、避暗实验和穿梭实验比较MT受体阳性激动剂对AD模型鼠认知功能的改善作用； （2）认知功能检测 ❶ Morris水迷宫 Morris 水迷宫作为最常用的动物神经行为学检测项目之一，被广泛应用于动物空间学习记忆的研究。该项检测能提供比较全面的实验参数，有效考察实验动物的空间认知能力，客观反映实验动物的学习记忆障碍。 A．定位航行实验：水迷宫训练，共历时4天，从给药第7天开始。每天将小鼠依次从四个象限，面向池壁放入池中，记录小鼠自入水到找到隐藏平台所需的时间，即逃避潜伏期。若小鼠找到平台并在上面停留10 s，则实验自动结束。若90s内小鼠未找到或爬上平台，则实验终止， |
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此时记录潜伏期为90s。然后将小鼠引导至平台上停留10s。将每只小鼠每天从四个象限入水逃避潜伏期的平均值作为当日的最终成绩进行统计。定位航行实验的前2日为可见平台训练（平台上方插黑色旗子），后2日将旗子撤去，进行隐蔽平台训练。 B．空间探索实验：于最后一次定位航行实验结束24小时后，即给药第11天进行。撤去隐藏的平台，将小鼠从任一象限放入水中，使其自由航行90s，记录小鼠在目标象限（原平台所在象限）停留时间占总测试时间的百分比（%），并进行组间对比。 ❷避暗实验 水迷宫实验结束后间隔一天，即给药第13天进行避暗实验。避暗装置分为明室和暗室，两室之间有一直径为3 cm的圆洞，暗箱底部铜栅通电。小鼠具有驱暗本性，此习性使其进入暗箱，但暗箱底部通电又迫使动物回到明室。多次训练后，小鼠会形成记忆并减少进入暗室的次数，而Abeta;1-42造模和治疗药物会分别削弱和增强这种记忆的保存时间实验分为两天，第一天训练，第二天测试。 A．训练期：先将小鼠放入避暗箱中适应5 min，后将小鼠背朝洞口放入明室，同时暗箱底部铜栅通40 V、50 Hz 的交流电，记录5 min内小鼠进入暗箱的错误次数，作为训练成绩，训练时潜伏期 (第1次进入暗箱的时间)大于180 s者弃去不用。 B．测试期：训练24h后，再次将小鼠背朝洞口放入明室，记录小鼠进入暗箱的潜伏期和5min内进入次数(错误次数)。若5 min内小鼠未进入暗室，则错误次数记为0次，潜伏期记为300 s。 ❸穿梭实验 穿梭实验可以定量描述小鼠主动回避反应等行为特征，是目前评估实验动物学习记忆能力常用的行为学测量仪器。小鼠穿梭实验装置主要由穿梭箱，电刺激控制器，盒式摄像机，信号采集卡及视频画面分割器组成。其中穿梭箱分为左右两室，两室之间有一直径为3.0cm的孔洞，箱底有铜栅，可通电。实验分为训练期和测试期。 A．训练期：将小鼠放入穿梭箱中适应5 min，先给予声音刺激5s，若小鼠不逃至另一箱体（穿梭），则给予电刺激（电流 10-20mA、频率 10-15Hz），小鼠逃至不通电的箱体，则电击结束，否则持续电击10s，60 秒后再次给予声音刺激。每只小鼠连续进行20次声音、电刺激，持续训练4天。结果采用主动回避反应（声音刺激小鼠即能完成穿梭动作，AAR）的次数、被动回避反应(经电刺激才能完成穿梭动作，PAR)的次数和失败(Fail)次数来评价小鼠的条件性学习记忆能力。 B．测试期：第5 天，按照训练期的方法记录A.潜伏期（active avoidance response Latency）：小鼠初次从通电箱进入无电箱时间；B被动回避潜伏期（escape response latency ,ERL）；C.主动回避次数（active avoidance response times, AART）；D.被动回避次数(escape response times, ERT)。 |
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