一、课题解决的问题
在生活水平普遍提高的当今社会，糖尿病已成为自心血管疾病和恶性肿瘤之后威胁人类健康的第三大杀手。其发病率呈上升趋势,已成为一种常见病、多发病。糖尿病的病因和发病机制至今仍不十分明朗,且目前临床尚无根治此病的药物。西药治疗糖尿病作用靶点单一,且不良反应较大,我国传统中药对糖尿病的治疗历史悠久,无毒副作用,可长期使用。现代科学表明，桑叶是优良的功能食品，它能降压、降脂、抗衰老和抑制有害的氧化物生成等。桑叶提取物可有效促进糖尿病患者恢复健康。此外，其抗血糖作用也已经被广泛报道[1]。
经研究表明，桑叶中的多糖，生物碱及黄酮类化合物等均具有不同程度的降血糖作用[2-5]。
陈建国等[6]的实验表明桑叶多糖能明显缓解糖尿病小鼠症状，陈玲玲等[7]的实验表明桑叶黄酮能明显降低糖尿病小鼠糖化血清蛋白, 促进其血清胰岛素、肝己糖激酶的分泌和肝糖元的合成, 提高肝ＳＯＤ活力、降低肝ＭＤＡ含量和促进体质量恢复，刘凡等[8]的实验表明桑叶总生物碱能明显降低D M 小鼠的空腹血糖值、采食量、肾脏指数, 增加D M 小鼠体重、胸腺指数。此外，
桑叶作为一味中药，其药理活性早就在多种研究中得到了肯定[9-12]，在医药和食品工业中应用广泛，但目前市场上桑叶提取物品种多且规格杂，本课题旨在对提供的桑叶提取物进行质量测定，主要目标为测定其生物碱含量并进行方法学验证。
二、研究方法和技术路线[13-15]
1.1生物碱衍生化分析色谱条件优化：
为准确高效地测定生物碱衍生化产物的含量，对色谱条件进行优化，确定生物碱的含量测定方法。最终确定夫西地酸有关物质联用鉴定的色谱条件为：Inersil ODS-RP (250mmtimes;4.60mm，4mu;m）色谱柱，以0.1%的甲酸溶液为流动相A相，0.1%的甲酸乙腈为流动相B相。检测波长为260nm，流速为1.0ml/min，柱温为15℃。按下表进行梯度洗脱:
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时间(分钟) |
流动相A相（%） |
流动相B相（%） |
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0 |
80 |
20 |
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3 |
62 |
38 |
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13 |
56 |
44 |
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17 |
20 |
80 |
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18 |
80 |
20 |
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23 |
80 |
20 |
1.2样品提取方法优化：
实验目的：配制不同超声时间的桑酮碱生物碱提取物，以考察生物碱提取的最优时间。
实验过程：称取桑酮碱提取物（140601）约50mg，加0.05M盐酸5ml溶解，分别超声20min、30min、45min、60min和90min，取80mu;l生物碱提取物于10ml离心管中，加入80mu;l硼酸盐缓冲溶液（pH 8.5），160mu;l FMOC-Cl（8mg/ml）的乙腈溶液，20℃反应20min后，加入80mu;l 0.1M甘氨酸和0.1%冰醋酸定容至8ml。
0.22um滤膜过滤，取续滤液10mu;l进样分析。
1.3 黄酮类成分衍生化分析
实验目的：对黄酮类提取物（总黄酮-083、总黄酮-087、总黄酮-1501）按生物碱衍生化方法进行FMOC衍生化，以分析黄酮类成分是否干扰生物碱类的衍生化反应。
实验过程:按照“样品提取方法优化”项下的衍生化方法，对黄酮类提取物（FLA-083、FLA-087、FLA-1501）进行衍生化。0.22um滤膜过滤，取续滤液20mu;l进样分析。
1.4 生物碱衍生化方法优化
1.4.1 衍生化试剂浓度优化-1
实验目的：采用不同浓度与不同体积比的衍生化试剂与桑酮碱（140601）生物碱类提取物反应，以考察反应达到平台期时生物碱衍生化的最佳浓度与最佳体积比。
实验过程:①取桑酮碱（140601）生物碱类提取物20mu;l于1.5mlEP管中，加入20mu;l硼酸盐缓冲溶液（pH 8.5），分别以（1：1、1：2、1：3、1：4、1：5）的体积比与FMOC-Cl（8mg/ml、16mg/ml、24mg/ml、32mg/ml）的乙腈溶液，20℃反应20min后，加入20mu;l 0.1M甘氨酸和0.1%冰醋酸至1ml，涡旋1min，15800r/min离心15min，取上清20mu;l进样分析。
1.4.2 8mg/mlFMOC-Cl衍生化重现性
实验目的：试验8mg/ml衍生化试剂浓度，1：2的体积比衍生化反应的重现性。
实验过程:②以8mg/ml衍生化试剂浓度，1：2的体积比，按照“衍生化试剂浓度优化-1”项下的衍生化方法衍生化6份样品。
1.4.3 衍生化试剂浓度优化-2
实验目的：试验加入桑酮碱（140601）生物碱类提取物100mu;l进行衍生化。
实验过程:②试验取桑酮碱（140601）生物碱类提取物100mu;l于1.5mlEP管中，加入100mu;l硼酸盐缓冲溶液（pH 8.5），分别与8mg/ml、12mg/ml、16mg/ml衍生化试剂200mu;l，20℃反应20min后，加入100mu;l 0.1M甘氨酸和500mu;l 0.1%冰醋酸，涡旋1min，15800r/min离心15min，取上清20mu;l进样分析。
1.4.4 衍生化硼酸缓冲盐体积优化
实验目的：试验生物碱类提取物：硼酸盐缓冲溶液（pH 8.5）：FMOC-Cl乙腈溶液的最佳体积比。
实验过程:试验加入桑酮碱（140601）生物碱类提取物100mu;l于1.5mlEP管中，分别加入硼酸缓冲盐（50mu;l、100mu;l、200mu;l），与12mg/ml衍生化试剂200mu;l，20℃反应20min后，加入100mu;l 0.1M甘氨酸和0.1%冰醋酸至1ml，涡旋1min，15800r/min离心15min，取上清20mu;l进样分析。
1.4.5 衍生化时间优化
实验目的：试验生物碱类提取物与FMOC-Cl的最佳衍生化时间。
实验过程:试验加入桑酮碱（140601）生物碱类提取物100mu;l于1.5mlEP管中，加入硼酸缓冲盐100mu;l，与12mg/mlFMOC-Cl乙腈溶液200mu;l，20℃分别反应15min、20min、30min、45min后，加入100mu;l 0.1M甘氨酸和500mu;l 0.1%冰醋酸，涡旋1min，15800r/min离心15min，取上清20mu;l进样分析。
1.5 桑酮碱提取物和生物碱类衍生化分析
实验目的：对桑酮碱提取物（140601、140602、140603、140604）和生物碱类（080、084、085、1501（因未注明批号，以送样时间15年01月编号））进行衍生化，测定各批次样品中生物碱的含量。
实验过程：
①对照品溶液的制备：精密称取1-脱氧野尻霉素标准品2.0mg，置25mL容量瓶中，用0.05M盐酸溶解并稀释至刻度，进行衍生化（精密吸取100mu;L 贮备液，依次精密加入100mu;L硼酸，200mu;LFMOC-Cl-乙腈，20℃反应15min，再加入100mu;L 0.1%甘氨酸和500mu;L 0.1%醋酸水溶液），涡旋1min，15800r/min离心15min，取上清20mu;l进样分析。
②供试品溶液的制备：精密称取各批次样品约50mg，加入0.05M HCL5ml超声提取45min后，3000r/min离心15min后，取上清，为桑酮碱生物碱类提取物。取生物碱类提取物100mu;l，加入硼酸缓冲盐100mu;l，与12mg/mlFMOC-Cl乙腈溶液 200mu;l，20℃分别反应15min后，加入100mu;l 0.1M甘氨酸和500mu;l 0.1%冰醋酸，涡旋1min，15800r/min离心15min，取上清20mu;l进样分析。
三、论文课题研究进度安排
2015年3月2日-2015年3月20日期间：查找文献确定课题，撰写任务书（可选）、撰写开题报告、翻译外文资料（可选）；
3月21日前指导教师上传学生的课题名称及相关内容；
3月21-25日期间：各专业负责人审核该专业学生的课题；在专业负责人审核之前，指导教师可以对已经上传的课题进行修正；
3月26-27日指导教师上传任务书、外文原文资料（两项皆可选）；
3月26日-3月31日：学生上传开题报告、外文翻译材料（可选）；
2015年4月中上旬：实习中期检查，学生填写实习中期检查表；
2015年5月30日前：学生完成毕业论文初稿；上传毕业论文初稿
四、文献综述
通过阅读文献，我了解到桑酮碱具有良好的降血糖功效，其中的生物碱起到了关键作用，因此市场上上市的相关产品应该保证的其中一点就是生物碱的含量必须达标。采用色谱联用技术可较为准确的测定桑酮碱中生物碱的含量。
参考文献：
[1]Naowaboot J., Pannangpetch P., Kukongviriyapan V., et al. Mulberry leaf extract restores arterial pressure in streptozotocin-induced chronic diabetic rats[J]. Nutr Res: 2009,29(8): 602-8
[2]卞慧敏 孟庆海， 殷秋忆， 郭静，. 4 种不同桑叶提取物降血糖作用的筛选[J]. 中成药: 2014,36(6): 1288-1291
[3]何羡霞，常化静，海洋，吴新荣. 桑叶生物碱、黄酮及多糖对HepG2 细胞胰岛素抵抗的改善作用[J]. 中国实验方剂学杂志: 2015,21(2): 192-195
[4]夏 杨 雨，欧阳臻，常 钰，孟. 桑叶不同组分降血糖作用研究[J]. 食品科学: 2007,28(08): 454-456
[5]玄光善，潘士佳，南姬. 桑叶有效成分降糖作用研究[J]. 食品科学: 2011,32(07): 323-326
[6]茵 陈建国，步文磊，来伟旗，刘冬英，梅 松，刘 臻，孙丽华，江月仙，傅 颖，王. 桑叶多糖降血糖作用及其机制研究[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs: 2011,42(3): 515-520
[7]陈玲玲 刘 炜 , 陈建国 ,步文磊. 桑叶黄酮对糖尿病小鼠调节血糖的作用机制研究[J]. 中国临床药理学杂志: 2010,26(11): 835-838
[8]刘凡 廖森泰, 李平平, 邹宇晓,吴娱明,肖更生. 桑叶总生物碱降血糖活性研究[J]. 广东省食品学会第六次会员大会暨学术研讨会论文集 2012,
[9]张欧 谭志平, 李颜屏. 中药桑叶的药理作用及其临床应用分析[J]. 中国医药指南: 2013,11(6): 265-266
[10]何昕. 桑叶的药理作用及其临床应用研究[J]. 实用心脑肺血管病杂志: 2012,20(6): 1071-1075
[11]鑫 刘国艳，魏晓蕊，叶 群，徐. 桑叶提取物对糖尿病小鼠降血糖效果的研究[J]. 扬州大学学报（农业与生命科学版）: 2013,34(4): 80-83
[12]邢冬杰，项东宇，张彩坤. 桑枝活性成分提取及药理作用研究进展[J]. 中国现代中药: 2014,16(11): 957-960
[13]尚磊，欧阳臻，赵明，王吉标，王璠，汪愿. HPLC-MS-MS 分析桑叶总生物碱组成及含量[J]. 中国实验方剂学杂志: 2014,20(2): 47-51
[14]陈万生 黄建明， 郭济贤 ，孙明明， 陆 斌 ，段更利，. 草乌中生物碱含量测定方法的研究[J]. 中药材: 2002,25(12): 878-880
[15]，王岩，吴新荣 王婴. 桑叶生物碱提取工艺研究进展[J]. 广 东 化 工: 2014,41(285): 90，94
一、课题解决的问题
在生活水平普遍提高的当今社会，糖尿病已成为自心血管疾病和恶性肿瘤之后威胁人类健康的第三大杀手。其发病率呈上升趋势,已成为一种常见病、多发病。糖尿病的病因和发病机制至今仍不十分明朗,且目前临床尚无根治此病的药物。西药治疗糖尿病作用靶点单一,且不良反应较大,我国传统中药对糖尿病的治疗历史悠久,无毒副作用,可长期使用。现代科学表明，桑叶是优良的功能食品，它能降压、降脂、抗衰老和抑制有害的氧化物生成等。桑叶提取物可有效促进糖尿病患者恢复健康。此外，其抗血糖作用也已经被广泛报道[1]。
经研究表明，桑叶中的多糖，生物碱及黄酮类化合物等均具有不同程度的降血糖作用[2-5]。
陈建国等[6]的实验表明桑叶多糖能明显缓解糖尿病小鼠症状，陈玲玲等[7]的实验表明桑叶黄酮能明显降低糖尿病小鼠糖化血清蛋白, 促进其血清胰岛素、肝己糖激酶的分泌和肝糖元的合成, 提高肝ＳＯＤ活力、降低肝ＭＤＡ含量和促进体质量恢复，刘凡等[8]的实验表明桑叶总生物碱能明显降低D M 小鼠的空腹血糖值、采食量、肾脏指数, 增加D M 小鼠体重、胸腺指数。此外，
桑叶作为一味中药，其药理活性早就在多种研究中得到了肯定[9-12]，在医药和食品工业中应用广泛，但目前市场上桑叶提取物品种多且规格杂，本课题旨在对提供的桑叶提取物进行质量测定，主要目标为测定其生物碱含量并进行方法学验证。
二、研究方法和技术路线[13-15]
1.1生物碱衍生化分析色谱条件优化：
为准确高效地测定生物碱衍生化产物的含量，对色谱条件进行优化，确定生物碱的含量测定方法。最终确定夫西地酸有关物质联用鉴定的色谱条件为：Inersil ODS-RP (250mmtimes;4.60mm，4mu;m）色谱柱，以0.1%的甲酸溶液为流动相A相，0.1%的甲酸乙腈为流动相B相。检测波长为260nm，流速为1.0ml/min，柱温为15℃。按下表进行梯度洗脱:
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