姓名

张娟

学号

1141928

专业

药物制剂

指导教师

徐寒梅

课题名称

mPEG-SC20k-HM-3部分作用机制研究

课题性质

radic; 基础研究 应用课题 设计型 调研综述 理论研究

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

拟研究或解决的问题

MAPK通路是信号从细胞表面到细胞核内部的一条重要的传递途径。多种细胞生理过程，如生长、发育、分化、分裂、凋亡等都涉及到MAPK信号转导通路的调节。在哺乳动物中MAPK成员主要包括细胞外信号调节蛋白激酶（extracelluar signal regulated protein kinase, ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase, JNK）和p38通路^[1]。目前有足够证据显示MAPK激酶参与了细胞粘附、细胞外基质的蛋白水解和细胞迁移的全过程。MAPK家族中的ERK是研究得最透彻的成员，ERK通路通过Ras-Raf-MEK-ERK1/2被激活，参与很多类型的细胞迁移^[2]。

蛋白激酶B或Akt（PKB/Akt）信号传导通路的异常经常出现在人类的一些恶性肿瘤中，而且与肿瘤的进展密切相关。作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，PKB/Akt 与细胞的生命活动密切相关，参与调节细胞的凋亡、增生、分化和代谢。PKB/Akt 信号传导通路还在肿瘤血管生成中起重要作用，PKB/Akt可磷酸化和活化内皮细胞的NO合成酶（nitric oxide synthase, eNOS）从而促进新生血管的形成和VEGF导致的细胞迁移^[3]。

mPEG-SC_20k-HM-3是整合素阻断剂类合成多肽，研究发现，它能够有效抑制内皮细胞的迁移。Matrigel实验显示mPEG-SC_20k-HM-3对新生血管生成有显著的抑制作用。此多肽序列设计中加入了整合素配体序列，一些肿瘤在发生、发展过程中会高表达某些整合素亚型，如alpha;_vbeta;₃，mPEG-SC_20k-HM-3与其结合抑制其表达及下游分子，则能够抑制肿瘤的发生和发展。本课题针对mPEG-SC_20k-HM-3抑制肿瘤的机理做进一步研究。

采用的研究手段

1、流式细胞仪检测mPEG-SC_20k-HM-3作用靶点的方法

1.1 3代人脐静脉内皮细胞HUVEC在6孔板中培养至80%的融合后，胰酶消化收集，用冰预冷的PBS洗2次，在标记前将细胞用含1% BSA的PBS重悬30 min。

1.2用20 micro;L鼠抗人alpha;_vbeta;₃ 功能阻断单克隆抗体(1.0 micro;g/micro;L, 1:200)与细胞悬液在4 ℃孵育1.5 h。

1.3标记后将细胞收集，并用冰预冷的PBS洗涤2次，之后用200 micro;L FITC标记的修饰多肽mPEG-SC_20k-HM-3 (2 mg/mL)与细胞悬液在4 ℃孵育1.5 h。

1.4标记后，将细胞收集并用冰预冷的PBS洗涤2次，之后用400 micro;L PBS重悬，用流式细胞仪分析，FITC荧光用FL1通道检测荧光强度。

2、Western Blot分析多肽mPEG-SC_20k-HM-3的信号通路的方法

2.1蛋白样品的制备

（1）3代人脐静脉内皮细胞HUVEC在6孔板中培养至80%以上融合后，加入多肽mPEG-SC_20k-HM-3终浓度为13、26、52、104、208 mu;g/mL，以PBS为空白对照。在37 ℃ 的CO₂培养箱孵育24 h；

（2）用0.25%胰蛋白酶消化细胞，计数，3000 rpm离心5 min收集细胞；

（3）按20 micro;L/1 times; 10⁵个细胞加入蛋白质提取液，吹吸打散细胞，4 ℃放置30 min使细胞裂解；

（4）加入1/4体积5 times; 蛋白质上样缓冲液，沸水浴5~10 min。

2.2 Western blotting检测

（1）取20 micro;L蛋白质样品，进行10% SDS-PAGE电泳；

（2）湿转移法将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，恒流100 mA，1-2.5 h；

（3）将PVDF膜用封闭液室温封闭2 h；

（4）PBST洗膜3次，每次5 min。加入一抗，4 ℃过夜或37 ℃ 孵育2 h；

（5）PBST洗膜3次，每次5 min。加入二抗，室温孵育2 h以上；

（6）使用ECL检测试剂盒在凝胶成像仪中对膜进行曝光。

进度安排

2014.3.1-2014.3.15：查阅文献，学习细胞培养和相关实验操作。

2014.3.16-2014.4.3 : 流式细胞仪实验检测mPEG-SC20k-HM-3作用靶点，western blot实验检测不同剂量的mPEG-SC20k-HM-3对细胞内整合素相关受体表达的影响。

2014.4.4-2014.5.1：western blot实验检测不同剂量的mPEG-SC20k-HM-3对细胞内整合素下游相关信号因子MEK1、p-MEK1、AKT1、p-AKT1的表达的影响。

2014.5.3-2014.5.30：western blot实验检测不同剂量的mPEG-SC20k-HM-3对细胞内整合素下游相关信号因子ERK1/2、p- ERK1/2。

2014.6.1-2014.6.22：准备答辩。

文献综述

抗肿瘤整合素阻断药的研究进展

张娟

（中国药科大学药学院，江苏，南京，211198）

摘要：整合素是一种介导细胞和其外环境（如细胞外基质，ECM）之间连接的跨膜受体,参与血管生成和肿瘤转移,与肿瘤的形成生长密切相关。以整合素为作用位点进行肿瘤治疗,可有效抑制肿瘤的生长和转移。本文主要从抗肿瘤生长类药物、抗肿瘤转移类药物、抗血管生成类药物等方面对近年来整合素阻断剂抗肿瘤药物的研究进展进行综述。

关键词：整合素，整合素阻断剂，抗肿瘤

1. 整合素

整合素是由alpha; （120~185kD）和beta;（90~110kD）两个亚单位形成的异二聚体，目前已发现18种alpha;亚基和10种beta;亚基，它们可组合成至少24种整合素分子。整合素可以与多种细胞外基质相互作用，根据与整合素连接的分子不同，可以将整合素分为四种不同类型：白细胞黏附整合素（leukocyte cell adhesion integrins），RGD结合类整合素（RGD-binding integrins），胶原蛋白结合类整合素（collagen binding integrins），层粘连蛋白结合类整合素（LN binding integrins）^[1]。 研究发现整合素与人类多种疾病有关，如肿瘤、血栓性疾病、炎症和感染性疾病等。

整合素蛋白是一类细胞黏附分子，在肿瘤新生血管生成过程中发挥重要作用，已成为肿瘤研究中的靶标分子之一^［2-4］。整合素作为粘附分子,可以调节细胞一细胞、细胞一细胞外基质(extracellula:matrix,ECM)间的粘附。整合素所介导的肿瘤细胞与肿瘤细胞、血管内皮细胞及ECM之间的相互作用影响肿瘤的发生、增殖、侵袭和转移到其他组织的能力。

2.抗肿瘤类整合素阻断剂药物

整合素是细胞表面黏附分子家族的重要成员，在多种肿瘤细胞以及血管内皮细胞表面高表达，主要介导细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的黏附作用，参与肿瘤的血管生成、侵袭和转移等过程。整合素成为许多抗肿瘤血管生成药物的靶点。目前抗肿瘤类整合素阻断剂的作用靶点有 RGD 结合类整合素alpha;vbeta;1、alpha;vbeta;3、alpha;vbeta;5、alpha;vbeta;6、alpha;vbeta;8、alpha;5beta;1，胶原蛋白结合类整合素alpha;1beta;1、alpha;2beta;1，以及alpha;9beta;1等[5]

按作用方式的不同，目前整合素阻断剂抗肿瘤药物可分为三类，即抗肿瘤生长、转移和抗血管生成类^[6]。

2.1.抗肿瘤生长类整合素阻断剂

Etaracizumab，又称为MEDI-522或Abegrin，通过将鼠抗人整合素alpha;vbeta;3单克隆抗体LM609进行人源化而获得，可以通过直接抑制黑色素瘤生长和间接抑制血管新生起到良好的抑瘤效果。[7]Etaracizumab还能直接作用于肿瘤细胞并通过抑制破骨细胞的黏附影响受损的骨质吸收,达到有效减少骨转移的作用[8]。

Volociximab 是一种嵌合的单克隆抗体，能够阻断纤连蛋白与整合素alpha;5beta;1的结合，直接抑制肿瘤细胞生长，也可通过抑制内皮细胞增殖，诱导内皮细胞凋亡间接起到肿瘤抑制效果。volociximab对晚期卵巢癌患者呈现良好的安全性和耐受性[9]。

2.2抗肿瘤转移类整合素阻断剂

S247是整合素alpha;vbeta;3阻断剂，可以抑制结肠癌肝转移，并诱导内皮细胞凋亡。PSK1404也是整合素alpha;vbeta;3的拮抗剂，可以通过抑制破骨细胞介导的骨质吸收，有效减少肿瘤骨转移。CNTO95能够识别多个alpha;v整合素，可以阻断整合素介导的细胞黏附和运动。ATN-161可以与多种整合素的beta;亚基结合，在多个临床前研究模型中显示出良好的抗肿瘤活性。

2.3抗血管生成类整合素阻断剂

血管生成类抑制剂特别是内源性多肽，由于其特异性强、安全性好、副作用小以及固相合成多肽技术的成熟而显示出良好的应用前景。

Cilengitide（EMD121974）是整合素alpha;vbeta;3和alpha;vbeta;5抑制剂，临床前实验证明可抑制内皮细胞增殖和迁移。无论是单一治疗还是与其它方法结合，抗肿瘤效果显著且安全性好。

Tumstatin的作用靶点是整合素alpha;vbeta;3，具有抗血管生成的活性，与贝伐单抗联用比单独使用时，对人肾细胞癌移植瘤显示出更好的抗肿瘤效果，仍处于临床前研究阶段。

Pentastatin是利用生物信息学方法分析血管生成抑制剂的同源性序列，筛选候选化合物而得到，作用于整合素alpha;vbeta;3和alpha;vbeta;1，能显著抑制内皮细胞增殖和迁移。

AP25含RGD-4C，作用靶点为整合素alpha;vbeta;3和alpha;5beta;1[10]。在小鼠移植瘤模型中，能够有效地抑制肿瘤生长，且与紫杉醇、顺铂等化疗药物相比，细胞毒性明显减小。本课题研究的mPEG-SC20k-HM-3作用靶点为整合素alpha;vbeta;3。

参考文献：

[1] Barczyk M ，Carracedo S ，Gullberg D. Integrins[J]. Cell Tissue Res ，2010，339（1）：269-280.

[2]Brown EJ.Integrin-associated proteins[J].Curr Opin Cell Biol,2002,14(5);603-607

[3]Burnett CA,Xie J,quijano J,et al,Synthesis,in vitro,and in vivo characterization of an integrin alpha;vbeta;3-targeted molecular probe for optical imagining of tumor[J].Bioorg Med Chem,2005,13(11);3763-3771

[4]Li C,Lu N,Qi Q,et al.Gambogic acid inhibits tumor cell adhesion by suppressing integrin beta;1 and membrane liqid rafts-associated integrin signaling pathway [J].Biochem Pharmacol,2011,82(12);1873-1883

[5]Cox D ,Brennan M,Moran N.Integrins as therapeutic targets;lessons and opporunities[J].Nat Rev Drudg Discow,2010,9(10);804-820

[6]Cheng T, Hu J L, Xu H M*. Development of Integrin Inhibitors in Anti-tumor Therapy[J]. China medical and pharmacy, 2012, 2(21): 44-47.

[8]Desgrosellier JS.Cheresh DA.Integrins in cancer;biological implications and therapeutic J].Nat Rev Cancer,2010,10(1);9-22

[9]Katherine M.Bell-MeGuinn,Carolyn M.Matthews,Steffan N.Ho,et al.A phase II,single-arm study of the anti-alpha;5beta;1integrin antibody volociximab as monotherapy in patients with platinum-resistant advanced epithelial ovarian or primary peritoneal cancer[J].Gynecologic Oncology,2011,121(2);273-279

[10]Zhang C, Yang Y J, Pan L, et al. Study on the in vitro activity of anti-tumor peptide AP25[J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2012, 28(10): 1375-1378.

学生签名： 张娟 2015 年 3 月 30 日

指导教师意见：

指导教师签名： 年 月 日

所在教研室审查意见：

负责人签名： 年 月 日