拟研究的问题:
两种不同大肠杆菌表达菌株TP001 和 TP002表达产量的比较。
课题背景:
目前单克隆抗体已成功应用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种症状。由于鼠源性单抗对人是异种抗原,在临床应用时,反复注射可使人产生抗鼠抗体,从而减弱或失去疗效,增加了超敏反应的发生,因此人们开始利用基因工程技术制备人源化或全人源单克隆抗体,以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。天演药业(苏州)有限公司将信息技术与生物技术相结合,自主开发出智能化抗体技术,用大肠杆菌表达系统表达出计算机设计合成的重组抗体片段,可准确、快速、有效地控制靶向人源化抗体的生成、优化及表达。
大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早,目前应用最广泛的经典表达系统。具有遗传背景清楚,目的基因表达水平高,基因克隆表达系统成熟完善;繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定等优点;目前,利用大肠杆菌表达系统可以高效表达抗体片段,用于抗体药物的上游筛选或直接生产抗体药物。
为了实现重组抗体片段高通量,自动化的表达和纯化,天演药业(苏州)有限公司构建了两种大肠杆菌宿主菌,分别为TP001和TP002。其中,TP001可以表达溶菌酶,在纯化过程中会自动破碎细胞,有利于目的蛋白的后续纯化及高通量操作。TP002在TP001的基础上做了改造,可以同时表达溶菌酶和核酸酶,在蛋白纯化过程中即可以破碎细胞,又可以消化细胞破碎后释放出的核酸,可以进一步提高蛋白表达纯化的通量。前期实验已经证明TP001可以自动破碎细胞,且不会对蛋白表达产量造成影响,此课题的目的是研究改造后的TP002是否能够降解核酸,且不会对目的蛋白的表达造成影响。
本课题中,抗体片段与His tag 标签融合表达,表达完成后,细胞破碎上清可直接通过金属螯合层析填料进行纯化,之后用SDS-PAGE对抗体片段进行初步鉴定,并用Nanodrop超微量分光光度计进行浓度检测。
实验流程:
1. 转化
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